大规模间充质干细胞培养技术评估报告

陈津，郭子宽，王立生，崔春萍，胡泽斌，吴朝晖，吴祖泽

20 世纪 70年代，人们发现了一种来源于中胚层、成纤维样贴壁生长的细胞，后来确定为间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）[1-2]。MSC 是一群具有高度自我更新能力和分化潜能的成体干细胞。因其具有免疫调控、分泌细胞因子、取材方便等优点而倍受关注，成为细胞治疗的理想种子细胞[3]。间充质干细胞研究日益受到广泛关注并显示出越来越广阔的应用前景，在细胞治疗、组织工程等领域具有极为重要的应用价值，是继造血干细胞之后临床应用研究最多，也是最成熟的一种成体干细胞。

1995年首次报道 MSC 应用于临床实验，现在培养的 MSC 已被广泛地用于临床实验研究，如移植物抗宿主病（GVHD）、充血性心力衰竭、急性心肌梗死、2 型糖尿病、脊髓损伤、软骨和骨损伤、克罗恩病等，而且在肾脏、肌肉和肺的损伤修复中也有初步进展[3]。虽然成体干细胞在许多疾病的临床研究中表现出令人振奋的疗效，但迄今为止，除了造血干细胞用于治疗血液系统恶性肿瘤外，尚未有其他成熟的成体干细胞作为常规的治疗方法进入临床实践。其中涉及的问题很多，包括干细胞疗法进入临床实践的政策法规保障、用来验证干细胞疗法安全性与有效性的合适的动物模型、临床治疗的评价方法与体系尚未完善、干细胞产品临床应用的技术标准及规范尚未健全以及相关的伦理学论证等。同时，MSC 培养工艺从实验研究模式转向大规模生产临床级的 MSC 还需要根据临床应用的要求，对培养技术各方面进行深层次的评估。本报告主要对大规模培养间充质干细胞的技术做一评估。通过对间充质干细胞体外培养技术的系统评价，为制定间充质干细胞临床研究管理规定提供相关信息，为细胞治疗准入制度的建立提供方法学依据。主要明确间充质干细胞的来源、分离方法、培养体系、保存、安全性、质量标准及质量监控评估等问题。

1 资料与方法

1.1 资料来源

① PubMed 数据库、EMBASE 和 MEDLIN数据库以主题词或关键词检索间充质干细胞（mesenchymal stromal cells）和细胞培养技术（cell culture techniques），限制研究对象为人类（human），文献检索时间不限，再根据不同的技术方法的主题词或关键词分别二次检索细胞来源（mesenchymal stem cell sources），无血清培养基（serum free medium），培养过程（culture processes, good manufacturing practices），细胞冻存技术（cryopreservation），基因组不稳定性（genome instability），肿瘤形成（tumor formation），质量控制（quality control），临床研究（clinical trial，clinical grade 和 clinical use）等。根据检索结果分类评估，根据问题和摘要逐一进行人工筛选。②广泛收集有关网站（如 NIH 临床试验登记网站 http://www.clinicaltrial.gov/、FDA 网站 http://www.fda.gov/ 和国际细胞治疗协会网站 http://www.isscr.org/ 等）的相关内容。③其他国家和地区有关的细胞治疗管理法案和技术报告。

1.2 纳入标准

⑴以间充质干细胞研究为对象；

⑵涉及细胞培养技术方面；

⑶涉及评估目标内容；

⑷以临床研究为目的；

⑸细胞治疗管理规定。

1.3 排除标准

⑴研究对象为动物；

⑵文献不含培养技术相关内容；

⑶其他干细胞研究内容；

⑷以基础研究为主；

⑸不含评估目标内容。

1.4 专家讨论

形成初步评估报告后，由卫生计生委科教司和中国医药生物技术协会组织相关专家进行讨论分析，形成评估报告和建议。

2 评估结果

2.1 MSC 的来源

MSC 可以来源于骨髓、脂肪、脐带、脐带血、胎盘、蜕膜、羊膜、羊水、皮肤、肌肉、牙髓、血管、滑液、心脏、脾、肾周脂肪、胚胎组织或胚胎干细胞、肠上皮组织、经动员的外周血等众多组织[2, 4-25]。

⑴骨髓间充质干细胞：骨髓一直是 MSC 的主要来源，成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）分析揭示，骨髓中 MSC 的量大约占单个核细胞数的万分之一到百万分之一。骨髓间充质干细胞（BMSC）是目前研究较为深入的一类成体干细胞。BMSC 易于外源基因的转染和表达，是细胞治疗、组织器官缺损修复及基因治疗的理想种子细胞。目前在 NIH 登记的骨髓 MSC 临床试验有 144 项，PubMed 上已发表的人骨髓 MSC 临床试验文章有 91 篇。

⑵脐带血间充质干细胞：脐带血是间充质干细胞的一个潜在的来源，Erices 等[26]在 2000年就报道了脐带血来源的单个核细胞中包含具有 MSC特征性表面抗原的细胞，并具有多向分化能力。与骨髓相比，MSC 在脐血中的比例更低，大约每 105～ 108个单个核细胞含有 1 个。但是由于脐带血库等网络的存在，脐带血有更为充足的来源，而且脐血的免疫原性较弱，不易发生免疫排斥反应，脐血受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的概率低，有利于临床的实际应用等优点，使得脐带血有可能成为生产临床级 MSC 的来源。事实上，早有以脐血成功治疗 HLA配型不完全匹配的恶性血液病和免疫缺陷病的报道[27]。目前在 NIH 登记的脐带血来源 MSC 临床试验有 10 项。

⑶脐带间充质干细胞：Covas 等[28]和 Romanov等[29]分别从脐静脉内皮和内皮下分离出一种成纤维样细胞，可分化为脂肪细胞和成骨细胞。同年，Mitchell 等[30]从脐带 Wharton’s jelly 中分离出间充质干细胞。脐带 MSC 表达基质细胞衍生因子-1（SDF-1）和血管内皮生长因子（VEGF），提示其具有治疗心脑梗死、脊髓损伤的可能。与骨髓 MSC相比，脐带 MSC 的 CFU-F 数、增殖能力和神经细胞诱导分化能力均高于骨髓 MSC，HLA-I 和CD106 分子表达低于骨髓 MSC，使它成为更理想的细胞治疗的种子细胞。目前在 NIH 登记的脐带来源 MSC 临床试验有 53 项。

⑷脂肪间充质干细胞：2001年，Zuk 等[31]首次从人脂肪组织中分离出一种多向分化干细胞，因其与骨髓间充质干细胞形态相似而称为脂肪间充质干细胞（ASC）。此后几个研究小组也先后采用相似的分离方法分别从脂肪组织中分离得到ASC。近年来许多研究表明，脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化的多分化潜能[6-7,25]。ASC和 BMSC 均表达 CD13、CD29、CIM4、CD105，均不表达 CD31、CD34、CINS、HLA-DR。脂肪干细胞作为一种来源广泛的自体干细胞有着不可比拟的优势。目前在 NIH 登记的脂肪来源 MSC 临床试验有 30 项。

⑸胎盘间充质干细胞：Zhang 等[32]首次从胎盘灌流液中培养出 MSC，并从生物学特征和功能等方面进行了系统研究。Fukuchi 等[33]从成熟胎盘小叶中得到间充质干/祖细胞，可表达数种干细胞标志性基因及组织特异性基因。后来学者陆续从人成熟胎盘的羊膜、绒毛膜、胎盘小叶、底蜕膜和壁蜕膜分离培养出间充质干细胞，且 RT-PCR 分析胎盘来源的间充质干细胞表达中胚层、外胚层和内胚层的相关基因。体外培养的胎盘间充质干/祖细胞具有多向分化潜能及造血支持和免疫抑制效应，其扩增能力优于成人骨髓 MSC。胎盘来源丰富、取材方便，MSC 易于分离，是 MSC 又一新来源。目前在NIH 登记的胎盘来源 MSC 临床试验有 7 项。

⑹羊水间充质干细胞：羊水与胎儿直接接触，除胎儿表皮、体腔管道等处的脱落细胞外，羊水中还可能存在来源于胎盘或桑葚胚的内细胞群的原始细胞[34]。1993年，Torricelli等[35]首次报道孕 12周之前羊水中有造血祖细胞，它可能来源于胚胎期卵黄囊。1996年，Streubel等[36]发现羊水中存在向成肌细胞转化的羊水细胞，可能为具有多向分化潜能的非造血祖细胞。 最近，In't Anker 等[37]证实孕中期（17～22 周）羊水中能够分离培养出胎儿MSC，但孕晚期（平均 38+ 周）羊水分离胎儿 MSC的成功率仅为 20%。目前的研究均采用超声引导下羊水穿刺技术在临床妊娠中期妇女做产前诊断时抽取少量羊水提取胎儿 MSC，这种操作技术虽已成熟，但取材过程中仍可能对胎儿和母体造成伤害，甚至引起流产、宫内感染等并发症。

⑺其他组织来源间充质干细胞：研究者还分别从分血管大隐静脉壁[28]、骨组织、骨骼肌、软骨及胎儿肺脏、胰脏、肝脏、肾脏来源的贴壁细胞和胎儿的真皮、肠上皮组织中成功分离出间充质干细胞。还有研究者使用胚胎干细胞分化成间充质干细胞。但是这些组织并没有稳定的来源，或者从伦理上并不适合作为临床大规模生产 MSC 的组织来源。Kassis 等[24]还从 G-CSF 动员的外周血中分离出 MSC。虽然有些报道称在外周血中检测到具有MSC 特征的细胞，但是通常 MSC 是不存在于正常供者的外周血中的[38-40]。

2.2 间充质干细胞分离纯化技术

不同组织来源的 MSC 分离方法不同，归纳起来主要可以分为两大类：①骨髓、脐带血、羊水来源的 MSC 以单个细胞存在于细胞群中，采用全骨髓法或全血直接培养方法，以及密度梯度离心分离、免疫磁珠或流式细胞分选的方式进行分离，利用 MSC 贴壁生长的特性进行纯化。如利用STRO-1 进行流式细胞分选可以获得 950 倍富集的 CFU-Fs[41]，其他细胞抗原如 a1-integrin subunit（CD49a）或 CD271（LNGFR）可以被用来富集骨髓单个核细胞[42-43]，但是这些方法富集的 MSC还没有达到完全纯化。而且许多抗体作为实验研究筛选使用，还需要发展临床级富集分选 MSC的抗体。②脐带、胎盘、羊膜、脂肪来源的 MSC 存在于组织中，需要用胶原酶、胰酶、透明质酸酶等消化分离成单个细胞后，再进行分离纯化，也可采用组织块法，利用 MSC 具有迁移能力的特性获得直接贴壁的 MSC。

2.3 MSC 体外培养技术

不管是来源于骨髓还是其他组织的间充质干细胞原始数量都是很有限的，要达到临床应用的细胞数量级，就必须经过体外的扩增培养。因此间充质干细胞体外扩增培养技术是 MSC 临床应用技术的关键。主要包括以下几个方面：

2.3.1 培养方式（培养体系）的选择 MSC 具有贴壁生长的特性，贴壁生长细胞常采取两种大规模的培养方法：①传统的平面培养方式：即保持相同细胞密度的前提下只是简单地增加细胞的培养体积。通过采用培养瓶或培养皿进行培养，为了培养大量的细胞，需要很大的表面积，因此需要大量的培养瓶和培养空间。Nunc 和 Coring 等公司生产了大的、多层的培养系统（1～10 层或者更多），可以叠加在培养箱中。这些培养瓶近似于一个封闭的系统，大大减少了培养瓶的使用数量，降低了被微生物污染的风险[44]。传统的培养方式简便易行，但是也容易污染，所以必须在符合 GMP 的洁净实验室内进行。②生物反应器3D 培养方式[44-51]：在生物反应器里培养 MSC 的优势包括相同体积下培养的表面积比较大、封闭的系统以及种植和收获的自动化[52]。这些技术能够为符合 GMP 条件下生产临床级 MSC 提供可选工具[3,53]。为了实现全封闭培养，减少细胞污染的几率，一些公司推出了细胞体外培养工作平台，如美国 Biospherix 干细胞工作站（stem cell workstation），引进低氧培养和低氧操作环境，适用于干细胞体外培养及临床移植前的干细胞样品的制备。工作站完全密闭不受外界干扰，杜绝由于实验员操作不当引起的细胞污染。不足之处就是这样的系统成本昂贵。

2.3.2 培养基的选择 培养基是 MSC 培养效率和安全的关键。选择使用的培养基需要能够维持MSC 在经过数次传代培养后的表型、功能和基因稳定，因此必须采用优化的培养条件。目前主要用于培养 MSC 的培养基有以下几种：

⑴含胎牛血清（FBS）的培养基：胎牛血清含有丰富的细胞生长因子、营养等物质。经典的 MSC培养条件就是基础培养基添加 FBS，但是 FBS 活性具有明显的批次间差异，而且在培养过程中，MSC 胞浆蛋白中可能残留 FBS，由此可能会导致患者过敏反应，以及可能引起如疯牛病（BSE）、克雅病（Creutzfeldt-Jakob disease）等疾病[54]。FDA 管理规范关于 GMP 生产细胞并没有绝对禁止使用FBS，但需要有安全证明（TSA）确保没有传染病传播的危险。也有一些权威的管理机构，如德国的PEI，就禁止使用 FBS。此外，从使用 MSC 的安全性角度要求有更安全的产品替代 FBS[55]，如人源的血清或成分确定的无血清培养基[56]。

⑵不含动物血清的培养基：许多研究者采用人源产品，如输血安全级的人 AB 血清或血小板裂解物来替代动物血清。这些产品来自于输血中心，可确保微生物的安全。经许多研究小组证明，使用血小板裂解物可以有效地替代 FBS[54-56]，很多临床研究单位也倡议使用血小板裂解物来实现临床级间充质干细胞的扩增培养[57]。

⑶成分确定的无血清培养基[4,11,58-76]：无血清培养基（serum free medium，SFM）就是不需要添加血清，通过像鸡尾酒式的添加生长因子（如FGF2、PDGF、TGF-β）就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖，能够维持培养的 MSC 主要的表型和功能特征[66]，但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。MSC 是贴壁生长细胞，无血清、无蛋白培养基缺乏血清中的各种黏附贴壁因子如纤连蛋白、层黏连蛋白等，因此需要添加这些组分以保证细胞贴壁。这就要求这些添加的蛋白需要在避免基因污染条件下生产。目前市场上的无血清培养基主要由几家国外大公司生产，其中一家已获得FDA 批准应用与临床研究（表 1）。然而事实上，目前的无血清培养基并不向商业公司说的那么好。许多研究证明了用含血清的培养基培养的 MSC不发生变异，但是对无血清培养基培养的 MSC 还需要进行相似的安全性研究，判断无血清培养基对MSC 基因稳定性的影响是否会导致肿瘤的形成。虽然理想的 MSC 培养基还没有形成共识，但无血清培养基是临床级间充质干细胞培养的最终方向。

2.4 细胞冻存技术

细胞冻存技术是间充质干细胞临床应用中很关键的技术。分离和生产的大量不同组织来源的MSC 需要可靠的长期保存方法，以备将来临床应用[77-87]。

2.4.1 冻存保护剂 冻存保护剂是深低温保存组织细胞不可缺少的部分。目前常用的低温保护剂有二甲基亚砜（DMSO）、甘油、糖类、羟乙基淀粉等。低温保护剂二甲基亚砜的浓度，以 10%（v/v）保存效果较佳；甘油则以 10%～15%（v/v）浓度为好。复苏后低温保护剂必须进行洗涤，从细胞悬液中清除，以降低低温保护剂的毒性影响。几种低温保护剂混合使用可减轻毒性，提高细胞存活率。如保护剂 CP-1 的主要成分为 DMSO 和羟乙基淀粉，这两种不同性质的冷冻保护剂联合应用，共同发挥作用，冷冻保护效果优于单独应用其中任何一种。

表1 市场上主要的无血清培养基

2.4.2 细胞冻存方式 干细胞的冷冻最好采用程控降温仪进行。利用程控降温仪严格控制降温速度（1～3）℃/min，经过相变（–11～–15 ℃）热释放之后加快降温速度，降至 –80 ℃ 或 –90 ℃，再转入液氮中（–196 ℃） 长期保存。有些研究者用乙二醇、丙二醇和蔗糖作为基础的细胞冻存保护剂来替代 DMSO，用聚乙烯醇作为辅料建立的直接放入液氮的玻璃化冻存方式实现了较好的细胞保存效果。

大量研究证明，保存的 MSC 并不改变 MSC的生物学特性，如分化、生长和表面标志物。在临床使用中最主要的问题是冻存保护剂的毒性，但DMSO 的毒性也可能被过度地评估，因为冻存的MSC 在临床使用前需要进行稀释，从而会减轻其毒性。

2.5 大规模培养 MSC 的安全性

间充质干细胞虽然在许多组织中都存在，但是其丰度都极低。因此，体外培养是完成细胞治疗必需的步骤。然而，与新鲜分离的间充质干细胞不同，细胞经体外培养扩增后，其生物学特性可能发生很大的变化。从培养体系的安全性来讲，间充质干细胞在体外培养过程中，与培养皿、分离液、血清、细胞因子等开放接触，易于受到热原和内毒素的污染，有造成受者医源性感染等不良反应的风险[88]。

2.5.1 基因稳定性[89-110]人体组织中原始 MSC含量很少，但是经过体外长期培养后可以扩增到很大的数量级。可以为临床应用提供大量的 MSC。通常，成人骨髓 MSC 可以稳定培养 6～10 代，而胎盘脐带 MSC 可以传 30～40 代。经过高分辨技术分析体外扩增的人骨髓 MSC，并没有发现DNA 复制数的畸变。但是在 MSC 长期培养过程中，发现与衰老相关的 CpG 位点发生修饰改变。研究者对不同供者来源的 MSC 的核型分析的结果表明，一般 10 代以内的 MSC 核型比较稳定，未发现变异情况。超过 10 代的细胞，核型发生变异，成瘤性风险增大。人间充质干细胞体外培养连续传代超过 20 次后，虽然细胞不具备裸鼠致瘤性，但其原癌基因和抑癌基因表达特征与 Ewing肉瘤相似。即使早期和晚期代数的 MSC 在基因组学上没有差异，也不能说明经过长期培养后基因组没有发生突变。突变的 MSC 可能不能存活或者因为正常 MSC 的优势生长，使得突变的 MSC 在长期培养过程中检测不出来。相反，如果突变的 MSC具有优势生长或者耐受衰老，那么对于临床应用更具有风险。

2.5.2 肿瘤形成[57,88,111-115]干细胞具有一些肿瘤细胞的特征，如能够长期的自我复制，寿命周期长，凋亡耐受等。此外，两者的生长调控机制很相似，因此干细胞可能恶性转化，这是使用干细胞药物产品安全性的主要担忧之一。一些研究报道通过转染端粒酶的MSC 可以在体外发生恶性转化[116]，然而，现在还没有实质证据证明常规体外扩增的MSC 具有致瘤性。NOD 小鼠体内毒性实验证明，MSC 在体内没有形成肿瘤。短尾猴的体内毒性实验进一步证明输注 MSC 后，短尾猴体内各项指标并没有发现改变。细胞毒性结果显示，MSC 并不影响试验猴的身体各项指标。Centeno 等[57,111]从2006年到 2010年，总共进行了 339 例患者的实验，MRI 检测并没有发现新生瘤的形成，随访至今是安全的。此外，许多 MSC 的临床研究报告也未报告安全问题。虽然 MSC 在培养过程中是否会诱导细胞的转化还不确定，但还是存在 MSC 在长期培养过程中发生突变的可能。因此必须在临床研究中应用 SNP 等分析手段来评价基因组的完整性。从 MSC 的增殖及分化、病毒学检测、核型分析、STR、HLA 等多个方面系统考察体外扩增过程中MSC 生物学特性和遗传学特性。

2.6 MSC 的质量监控

临床使用 MSC 的安全性直接与整个过程的质量控制相联系。生产安全的细胞产品要求对整个过程进行监管，确保培养细胞的基因型和功能性，确保培养的细胞未分化和无微生物的污染。在MSC 扩增培养过程中面临着许多风险，如细菌污染、细胞变异、衰老等。

2.6.1 间充质干细胞的标准 间充质干细胞能表达多种表面抗原但不特异，这些表面抗原也可在基质细胞、内皮细胞和表皮细胞出现，但不表达造血干细胞标志物。现已发现的表面抗原表达阳性的有CD29、CD44、CD59、CD71、SH2、CD73、CD105、CD106、CD166、CD271 等，而 HSC 表面标志CD3、CD14、CD34、CD38、CD45、CD56、CD117、人白细胞抗原（HLA-DR）表达均为阴性。不同研究者选用不同的组合来鉴定，各研究结果之间很难相互比较[117]。为了解决这个问题，国际细胞治疗协会提出了一个鉴定 MSC 的最低标准[118]：首先，MSC 必须是贴壁生长的；其次，MSC 必须表达CD105、CD73 和 CD90，同时不表达 CD45、CD34、CD14/CD11b、CD79α/CD19 以及 HLA-DR；第三，在体外 MSC 必须能够分化成骨、脂肪和软骨。

2.6.2 间充质干细胞的质量监控[3,53,57,119-130]MSC质量监控包括生产环境的细菌和真菌的检测，药品化生产 MSC 的环境要求每 2 周至少进行一次无菌的检测[131]。收获细胞质量控制必须确保含有足够量的干/祖细胞，能够达到临床应用的数量要求，还应排除传播传染性疾病的可能。质量控制应包括细胞培养的全过程。包括分离细胞前的供体血清学检测，主要是免疫缺陷病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等。对于原始干细胞数量的检测，现在唯一的定量检测是 CFU-F，但是检测时间太长，不可能在取样时得到结果，只能作为后续的评判标准。因此，只有检测有核细胞数和活性来验证起始干细胞。培养过程中，要不断监测细胞。当 MSC 被分离出来后，确保分离的细胞质量良好。这些质控包括细胞计数、细胞活性鉴定、表型分析、CFU-F 形成分析，细菌污染检测等。在治疗前必须对细胞进行质量判定，根据质控结果判定这些细胞是否能够被用于临床。这些质控方法必须快速、精确，适用于临床治疗要求。这样的质控包括细胞计数、评价细胞活性和流式测定细胞表型、细菌学检测、细胞功能、基因稳定性等。通常的 MSC 分化能力鉴定中，诱导分化需要 2～3 周才能知道结果，有研究者提出采用 PCR 方式检测一些可用于鉴别的基因，以检测 MSC 是否保持未分化状态以及它们的分化潜能[132]。近来，MSC 在培养过程中的变异风险引起了大家的注意，如何判定临床使用经体外扩增培养的 MSC 基因是否突变、细胞是否发生转化、细胞是否已经老化等问题成为研究者关注的热点。细胞发生转化过程主要表现在端粒酶表达、核型突变和注射到免疫缺陷小鼠内生长肿瘤。这些风险使得必须进行特殊的质控，最快速的方法就是通过 QPCR检测端粒酶。

3 讨论

通过对现有综述、书籍和专利等文献资料进行综合对比分析，对大规模临床级间充质干细胞培养的各方面技术进行了综合评估。MSC 的来源广泛，骨髓来源研究最早最多，尤其在免疫调控和分泌因子方面具有其特有的优势。胎盘、脐带、羊膜作为分娩后的废弃物获取干细胞简单，对于新生儿及产妇没有任何痛苦和不良影响，且易于接受，不会涉及社会、伦理及法律方面的更多争议。其他组织来源如羊水、肌肉、血管、骨组织、骨骼肌、软骨等从材料来源或伦理上并不适用于临床大规模生产。因此骨髓、脐带、脐带血、胎盘、脂肪等更适用于作为临床大规模培养 MSC 的来源。

间充质干细胞的分离方法可以采用最少处理的全骨髓法、组织块法的方式来进行分离，经典的密度梯度分离或流式分选的方式是目前较常用的方法。密度梯度分离液最好使用 GMP 级别的[44]。MSC 大规模培养方式最好选用全封闭条件下的生物反应器培养，但是该方法设备价格比较昂贵，技术要求较高，不好观察细胞生长情况。因此，目前多数还是在 GMP 实验室内采用传统的平面培养方式[53]。在培养基的选择上，动物源的成分需要用人源的或化学成分确定的成分来代替，以减少可能引起患者致病的风险。如果使用动物源的物质必须根据现有药品指南的规定，在用于人体前进行残留量检测。无血清培养基是临床级间充质干细胞培养的最终方向。

冻存的 MSC 并不改变 MSC 的生物学特性，如分化能力，生长和表面标志物等。选择适宜的冷冻保护剂种类和浓度，应确定间充质干细胞在不同冻存保护液下适宜的降温速率。同时亦需考虑干细胞解冻复苏后保护剂的清除及保护剂对临床输注的影响。DMSO 作为 FDA 批准可以用于临床的冷冻保护剂，是当前最常用的。其对人体的毒副作用日益受到重视。因此，MSC 冻存保护剂中的DMSO 应在临床使用前被洗涤和稀释。玻璃化冻存还有待于进一步得到研究者的公认。开发毒副作用轻微的新型冷冻保护剂也颇为重要。

安全性仍然是细胞治疗的主要担忧之一。培养的细胞在 8～10 代以内安全稳定，无变异，未发现致瘤性，可以安全用于临床研究使用。为了确保细胞的安全性和有效性，必须建立严格的质量控制，包括供体来源，培养过程的微生物检测，细胞表型、功能分析，细胞活性、数量以及基因稳定性检测等。

随着 MSC 临床应用的增加，建立临床级间充质干细胞培养的规范直接关系到这个领域能否健康发展。目前，国际组织及一些发达国家，如美国、欧盟、日本、澳大利亚等已经制定了体细胞治疗的许多管理规范和标准，如国际细胞治疗协会的《干细胞临床转化指南》、美国 FDA 的《人类细胞、组织，及细胞和组织相关产品生产的优良操作规范（cGTP）》、欧盟的《人类组织和细胞捐献、采集、检测、处理、保存、储存和分发的质量和安全标准》以及国际细胞治疗认证委员会的《细胞治疗产品收集、处理和管理国际标准》等[133-143]。我国干细胞治疗还缺乏相关的管理规范，亟需权威部门制定一套标准指南，引导我国干细胞临床研究的健康发展。

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