核酸恒温扩增－免疫层析技术在布鲁菌病诊断中的应用

张慧慧，刘凡瑜，姚 燕，陈泽良，孙桦楠，甄 清

（1.吉林大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室，吉林 长春 130021；2.解放军军事研究院疾病控制所，北京 100071；3.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林 长春 130062）

布鲁菌病（布病）是由布鲁菌侵入机体而引起传染－变态反应的人畜共患传染病。分离培养、免疫学和PCR等方法都可以作为布病患者的实验室检测诊断手段，但不同方法的结果并不完全拟合，迄今为止，分离培养仍是确诊布病的最可靠证据［1］。由于病原分离培养方法存在生物安全问题，培养需要几天至几周时间［2］，普通实验室不能开展，因此目前实验室仍应用基于抗原抗体的免疫学检测方法，如试管凝集试验（SAT）。SAT操作简便，易于判定，我国将其列为动物布病诊断的国家标准［3］。但由于抗体的检测方法存在空窗期，即抗体未产生或未达到诊断标准前，往往造成漏诊，因此替代分离培养及抗原抗体的免疫学检测方法的其他实验室检测方法是近期研究的热点。核酸恒温扩增方法采用交叉引物的恒温扩增，在扩增中引入标记探针，结合对扩增产物的免疫层析检测技术，实现了对目标核酸分子的高敏感度和高特异度检测［4］。其突出特点是操作简便，结合免疫层析检测装置，肉眼可直接进行结果判定，不需特殊仪器。若能将该方法在布病实验室诊断和流行病现场筛查中推广应用，对于降低人畜布病漏诊率具有重要意义［5］。本研究以布病门诊就诊者的全血为样本进行检测，

与免疫学指标进行对比，对不同病期就诊者的检出率进行分析，同时结合就诊者临床背景资料以及流行病学接触史加以分析，了解该检测方法在不同临床就诊者中的诊断意义和应用价值，为核酸检测标准化推广应用提供实验室参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2012年2—8月在吉林省松原市疾病预防控制中心布病门诊就诊且有布病临床表现及流行病学接触史的就诊者190人，收集就诊者的抗凝全血（以枸橼酸盐为抗凝剂）；非抗凝血4℃过夜分离血清。结合实验室SAT检测结果将研究对象划分为：SAT≥1∶50为阳性就诊者115人，SAT＜1∶50为阴性就诊者75人。

1.2 主要试剂及仪器 红细胞裂解液：55g蔗糖、1moL·L－1的 MgCl22.5mL、5mL Triton X－100及5mLTris－HCl，ddH2O定容至500mL，高压灭菌。Triton X－100购自美国Sigma公司；PBS购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；布鲁氏菌恒温扩增核酸试纸条检测试剂盒购自杭州优思达生物技术有限公司；一次性核酸检测装置购自杭州优思达生物技术有限公司。

1.3 引物设计 布鲁氏菌恒温扩增核酸试纸条检测试剂盒（杭州优思达生物技术有限公司）针对布鲁氏菌0BMEI0536基因序列设计了2对特异性引物（F3／B3和F2／PR）和1对特异性探针（5F／5B），引物序列如表1。

表1 恒温扩增引物Tab.1 Primers of isothermal amplification

1.4 样本核酸提取方法 ①血液样本的核酸提取：取0.3mL抗凝全血，加等量红细胞裂解液，充分混匀后室温静置10min，12000r·min－1离心2min，弃上清；向沉淀中加入PBS 1.0mL，重悬沉淀。12000r·min－1再离心2min，弃上清。加500μL 2%Triton X－100，重悬沉淀，室温静置5min，12000r·min－1离心2min，弃上清，加入ddH2O 30～50μL；封口膜封口，沸水浴10min。12000r·min－1离心5min，上清即为模板。②血清样本的核酸提取：40μL血清与检测试剂盒中等量DNA提取液充分混匀，沸水浴10min，4℃静止10min，12000r·min－1离心5min，吸取上清至清洁离心管，即为血清样本的布鲁氏杆菌模板。

1.5 核酸恒温扩增 确定反应液的管数，进行标记；反应液管4000r·min－1，离心3～5s；在反应液管中直接加入10μL ddH2O，作为阴性对照；在剩余的反应液管中各加入6μL ddH2O，然后分别加入4μL处理好的待测样本或阳性对照；将反应管瞬时离心；60℃、60min水浴扩增。

1.6 恒温扩增－免疫层析装置操作方法 将经过扩增的反应管（不可开盖，以避免污染）放置在装置固定盒中，用力压下，15min后可通过阅读窗判读结果，阳性、阴性对照成立的情况下即可观察和记录样本检测结果。

1.7 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，配对设计2组频数分布采用配对校正χ2检验，a＝0.05；核酸恒温扩增－免疫层析检测法与SAT检测法的符合率采用筛检实验分析。

2 结 果

2.1 29例就诊者的全血和血清分别作为样本提取核酸结果比较 190例就诊中采集到29例就诊者的全血和血清，应用核酸恒温扩增－免疫层析方法检测29例就诊者的全血和血清，以全血为样本核酸扩增阳性率为55.2%（16／29），以血清为样本核酸扩增阳性率为23.1%（6／29），经配对χ2分析χ2校正＝8.1，P＜0.05，表明全血和血清作为布鲁菌核酸提取样本的差异有统计学意义。全血作为布鲁菌核酸提取样本的敏感性优于血清。见表2。

表2 29例就诊者全血和血清样本核酸恒温扩增－免疫层析检测结果Tab.2 The results of nucleic acid isothermal amplification-immunochromatographic test of blood and serum samples of 29cases

2.2 190例就诊者核酸恒温扩增检测法与SAT检测法符合率分析 190例不同病程就诊者应用SAT检测，115例为SAT≥1∶50的阳性就诊者，75例为SAT＜1∶50的阴性就诊者。对190例就诊者均以全血作为核酸提取样本，并进行核酸恒温扩增－免疫层析检测，检测结果与SAT检测结果比较见表3，2种检测方法的符合率为57.9%。

2.3 93例首次就诊急性早期布病患者核酸恒温扩增检测法与SAT检测法符合率分析 93例首次门诊就诊的急性早期布病患者（病程在3个月内）的SAT检测，61例SAT≥1∶50的阳性就诊者，32例SAT＜1∶50的阴性就诊者，93例就诊者均以全血作为核酸提取样本，并进行核酸恒温扩增－免疫层析检测，检测结果与SAT检测结果比较见表4，2种检测方法符合率为63.4%。

表3 190例就诊者SAT和核酸恒温扩增检测结果分布Tab.3 The distribution of SAT and isothermal amplification test results of 190cases

表4 93例首次就诊的急性早期布病患者SAT和核酸恒温扩增检测结果分布Tab.4 The distribution of SAT and isothermal amplification test results of 93patients with acute early brucellosis seeing the doctor at the first time

3 讨 论

分离培养作为布病实验室诊断的金标准，在本次临床样本验证中尚未分离出布鲁菌，在以后的实验中将继续进行临床样本分离。随着分子生物学的发展及其在人畜共患病领域的广泛应用，特别是对于难于培养和培养时间长以及存在生物安全问题的病原体的检测具有重要意义，基于核酸扩增方法已应用于布病的辅助诊断［6］。近年来，国内外已将该法应用于细菌性疾病、病毒性疾病和寄生虫病等多种动物疫病［7－8］的检测方面，但由于该方法缺乏标准化，而未能得到推广应用。本研究中核酸恒温扩增－免疫层析检测法不需要变性过程，扩增效率也得到提升，理论上检测敏感性为PCR方法的10～100倍［9］，扩增微量DNA有效地检测出布鲁菌，对早期感染的检测比免疫学检测方法更灵敏［10］。且实验所设计引物为多对，具有较高敏感性，有研究［11］已对引物序列扩增的核酸片段进行测序，并与常见的其他病菌核酸进行过交叉扩增实验，未出现交叉扩增，具有较高的特异度。

据文献报道：在全血或血清作为核酸提取样本方面不是所有的研究均得到一致的结论。Zerva等［12］使用血清和全血样本检测了31例布病患者，血清检出率为61%，而全血检出率为94%。Vrioni等［13］检测血清样本的阳性率为17.7%，而全血为20.2%。本研究全血作为样本提取核酸进行恒温扩增阳性率较血清作为样本提取核酸进行恒温扩增阳性率高，与Zerva等报道结果一致。

在提取核酸方法方面，布鲁氏菌恒温扩增核酸试纸条检测试剂盒提倡用血清，血清中PCR抑制因子少，用量少，核酸提取过程简单，但重复检测出现假阴性，可能是由于核酸在血清中的含量少、易被破坏、分布不均等，或样本例数少影响检测敏感性所致。而血液提取核酸过程处理相对复杂，易受血液中其他成分干扰，操作中裂解是否充分，血红蛋白去除效果等均可能会影响检测结果，重复测量某些样本出现假阴性现象。但血液中提取核酸用量大、含量高，提高就诊者的核酸发现率。

王丽等［14］对不同病程布病患者的98份全血样本进行PCR检测，仅有2份全血出现微弱阳性，阳性率仅为14.3%，不能有效地鉴别诊断布病。核酸恒温扩增－免疫层析检测方法在普通PCR基础上进行改进后对190份全血样本进行检测，与免疫学检测法SAT的符合率为57.9%，对鉴别诊断布病患者和非患者无参考价值，这一结果与其他基于核酸检测的报道一致。

国外学者［15］认为：核酸恒温扩增在急性早期和治疗后的随访有较高的临床应用价值，对93例首次就诊急性早期布病患者的全血进行核酸恒温扩增－免疫层析检测，与免疫学检测法SAT的符合率为63.4%，验证了其在急性早期布病的临床应用价值；为急性早期布病患者在抗体滴度尚未产生或未达到诊断标准时提供实验室参考及治疗依据，避免因漏诊而错过最佳治疗时期，如果转为慢性期，将导致疾病迁延不愈。由于布病病程长短不一，核酸恒温扩增在首次就诊发病3个月内的就诊者中应用的特异度较低，假阳性率高，建议追踪随访首次就诊SAT检测阴性者，监测其在潜伏期内是否会转变为患者，降低假阳性率。增加样本量，进一步验证核酸恒温扩增检测在急性早期布病及治疗后随访中的临床应用价值。

综上所述，虽然目前用于布病的诊断方法很多，但均有一定的局限性，尚未有一种方法能适合所有情况布病的检测诊断，各种技术不能互相代替，综合多种检测方法并结合就诊者临床背景资料以及流行病学接触史加以分析，才能减少漏诊的发生。本实验所建立的核酸恒温扩增－免疫层析法，扩增过程不需要温度循环，因此不会受到双链DNA的污染，将核酸扩增试剂研制成试剂盒，并与免疫层析技术相结合研制出直接判读结果的装置，推进了标准化检测，简化了操作步骤，降低了操作过程中的危险，而且有效减少了漏诊的发生。

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