C6脑胶质瘤模型大鼠MRI影像及形态学观察及其意义

周 颖，袁 博，马 越，张 琨，高 峰，王 皓，芦 晋，吴晓刚，佟 丹，袁长吉

（1.吉林大学第一医院肿瘤中心，吉林 长春 130021；2.吉林大学第一医院放射线科，吉林 长春1300213.吉林省疾病预防控制中心，吉林 长春 130062）

神经胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤之一，其发病率约占颅内原发肿瘤的40%～50%［1］，目前脑胶质瘤的治疗以手术治疗为首选，辅以放化疗。但由于胶质瘤具有侵袭增殖特性，难以做到完全切除，其对放疗不敏感，而化疗药物不易通过血脑屏障，脑胶质瘤患者的治疗效果往往难以令人满意，平均生存率不超过1年［2］，因此寻找和研制能透过血脑屏障的抗胶质瘤药物是脑胶质瘤治疗亟待解决的问题。本研究在建立可模拟胶质瘤临床病理过程稳定的动物模型的基础上，对模型动物脑瘤体进行磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）影像动态观察及病理形态学观察，选择适当的时间窗，旨在为抗脑胶质瘤药效学研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株和实验动物 C6大鼠胶质瘤细胞株购自ATCC公司，雄性Wistar大鼠购自吉林大学实验动物中心，动物合格证编号：SCXK（吉）2008－0005；许可证编号：SYXK（吉）2008－0011，体质量为180～200g。

1.2 主要试剂和仪器 DMEM（Gibco公司），胶质酸性纤维蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（Dako Denmark A／S公司，丹麦），二抗（Abcam公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），10%水合氯醛（按0.3mL·100g－1配置用于腹腔注射麻醉）；CO2培养箱，Olympus倒置显微镜，大鼠脑立体定向仪（吉林大学第一医院转化医学研究院），1.5T磁共振仪（Simens1.5TAVANTU1.5T超导型磁共振共振仪FR扫描系统）、大鼠专用线圈（Simens公司）。

1.3 细胞培养 大鼠C6胶质瘤细胞置于含10%胎牛血清、100U·mL－1青霉素和100U·mL－1链霉素的DMEM高糖培养液中，于37℃、5%CO2条件下培养，每2～3d换液传代。取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化，收集细胞制成单细胞悬液，台盼蓝排斥实验鉴定细胞存活率大于95%，调整细胞浓度为5×107mL－1，冰浴存放待用。

1.4 模型制作 ①Wistar大鼠术前12h禁食禁水。②大鼠的麻醉、固定与消毒 ：大鼠经腹腔注射10%水合氯醛（0.3mL·100g－1）麻醉后，剪去头顶部毛发，固定于大鼠立体定向仪上。碘伏消毒，切开头皮，暴露颅骨。③确定接种部位：取冠状缝前1mm、矢状缝左侧3.5mm交点处，用直径约1mm的微孔钻钻孔。④细胞接种：用50μL微量注射器吸20μL单细胞悬液，垂直延伸至硬膜下6mm，然后后退1mm，将其细胞悬液以1μL·min－1速度注入靶区。除针前停留5min，避免反流。颅骨钻孔用骨蜡封闭，4号线皮肤缝合，碘伏消毒。⑤ 细胞接种完毕后，注意保持大鼠体温和呼吸道通畅，予侧卧位，保持室内温度，直至大鼠恢复正常活动和饮食。

1.5 术后处理 ①大鼠生存状况观测：观察、记录大鼠行为改变与生存时间。②MRI检查：接种肿瘤的10只大鼠分别于术后第2、3和4周采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，固定于大鼠颈部线圈上，使用Simens AVANTU1.5T超导型磁共振共振仪FR扫描系统行俯卧横断位、冠状位T1WI扫描。扫描参数：T1WI采用SE序列；常规扫描：轴位、冠状位T1WI（TR／TE＝3070／66ms扫描，FOV＝10cm×10cm，层厚2mm。③病理学检查：荷瘤大鼠自然死亡后立即取脑组织，于进针处冠状切开，大体观察瘤体，并进行常规病理学检查。病理切片及HE染色制作：取材、固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片、HE染色（脱蜡、脱苯、复水、染色、脱水、透明、封固）、封片。④GFAP检测：采用免疫组织化学法检查脑肿瘤组织中GFAP的表达，其阳性表达说明形成的脑肿瘤具有神经胶质瘤的特性。

2 结 果

2.1 荷瘤大鼠生存状况 大鼠术后2周出现活动和进食量减少、皮毛污秽及结膜充血等表现；3周后，个别大鼠出现肢体抽搐、偏瘫、身体扭曲和自身旋转等神经系统症状，10只模型动物分别于8、10、13、14、15、21、22、23、27和30d死亡。本组荷瘤大鼠中位生存期为18d，平均生存期为（18.3±7.3）d。

2.2 MRI检查 10只大鼠均可见左侧尾状核部有新生物生成，T1像呈稍低信号或等信号，新生物直径约5～10mm，边界较清楚（图1）。

图1 大鼠接种脑胶质瘤细胞后2（A）、3（B）和4（C）周 MRI动态观察（T1像）Fig.1 Coronal contrast enhanced（T1－weighted） MRI dynamic scanning images in 2（A），3（B），4（C）weeks after implantation of glioma cells in rats

2.3 病理学检查 荷瘤大鼠脑瘤体随着瘤龄的增加而增大，瘤体大体观察结果见图2。病理学检查显示肿瘤细胞排列混乱致密，核分裂相易见，肿瘤内可见有血管组织增生，肿瘤浸润性生长呈指状突入周边正常组织（图3，见插页三）。免疫组织化学染色显示：荷瘤大鼠C6胶质瘤细胞中GFAP阳性表达。见图4（插页三）。

图2 大鼠C6脑胶质瘤大体病理学表现Fig.2 Macropathological appearence of rat C6glioma

3 讨 论

本课题组多年来从事甲基汞所致脑发育损伤机制的研究［3－5］。通过长期科研实践的积累，推测氯化甲基汞（MgHgCl）具有治愈脑胶质瘤的潜能，提出用MgHgCl治疗脑胶质瘤的新思路，并通过抗肿瘤实验证实其有明显的抗肿瘤活性［6－10］，并申请国家发明专利，已获授权（ZL 200410010827.7）［11］。本课题组进行 MgHgCl抗胶质瘤活性和甲基汞－L－半胱氨酸（MMC－L－cys）共轭物通过L型大分子中性氨基酸转运载体1（LAT1）增强其靶向转运和细胞毒作用的实验研究，在进行药物的抗肿瘤体内实验研究过程中，建立大鼠C6脑胶质瘤模型，选择适当的时间窗至关重要。虽然已有多种胶质瘤模型文献报道［12－13］，但存在着动物种类、细胞来源、接种方法、位置和接种量的大小等方面差别。本课题组曾采用C6细胞立体定向移植的方法制作Wistar大鼠颅内胶质瘤模型，已成功地建立了大鼠脑胶质瘤模型［14］，C6细胞生长稳定，而且在Wistar大鼠中有较好的相容性，可以获得较高的成瘤率，模型成功率达100%，并证实大鼠成瘤后可出现明显的行为学改变，有较典型的症状。本实验中免疫组织化学检查结果显示：脑肿瘤组织中GFAP阳性表达，说明形成的脑肿瘤具有神经胶质瘤的特性；其特点也符合胶质瘤的临床表现。病理学方面也显示出肿瘤呈侵袭生长，呈指状长入瘤周脑组织中，但以往研究未对荷瘤动物脑瘤体进行MRI和MRI动态观察，导致给药时间上的盲目性，不能更好地评价 MgHgCl和MMC－L－cys共轭物抗胶质瘤的活性。本研究在以往建立的大鼠C6胶质瘤动物模型基础上，对模型动物脑瘤体进行MRI影像动态观察，MRI显示肿瘤生长部位恒定，并随着瘤龄的增加而增大，选择适当的时间窗（瘤龄2周、瘤体5mm）进行抗脑胶质瘤药效学研究，可更好地评价药物的抗肿瘤活性，亦为其他抗胶质瘤药物的药效学研究提供了借鉴。

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