二甲基砜／聚乙烯醇水凝胶的制备及其生物学特性评价

王 昊，崔巍巍，徐冰涵，于 婷，2，章培标，刘 娅

（1.吉林大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，吉林 长春 130021；2.吉林大学第二医院营养科，吉林长春 130041；3.中国科学院长春应用化学研究所中国科学院生态环境高分子材料重点实验室，吉林 长春 130022）

聚乙烯醇（PVA）是由聚醋酸乙烯酯水解获得的一种水溶性高聚物，由其制备的水凝胶化学性质不活泼、无毒，PVA良好的力学性能和对水分子等的透过性使其具有优良的生物相容性，PVA良好的柔韧性及高弹性可降低其对周边细胞和组织的机械刺激。因而，PVA水凝胶可作为创面敷料和缓释药物载体等［1－4］。二甲基砜（MSM）是人体胶原蛋白合成的必要物质，不仅具有良好的镇痛作用，还能促使伤口愈合、加强血液循环等，在医药领域应用广泛［5－7］。目前，有关将 MSM应用在水凝胶敷料中的研究尚未见报道。本文作者将MSM溶解在PVA水溶液中，采用反复冷冻的物理交联方法制备 MSM／PVA水凝胶，并评价其性能，探讨MSM／PVA水凝胶作为人工敷料的可行性。

1 材料与方法

1.1 细胞、实验动物、试剂和主要设备 小鼠成纤维细胞L929，购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；豚鼠40只，体质量（425±25）g，购于吉林大学实验动物中心。PVA（SCRC国药集团化学试剂有限公司）、MSM（辽宁省盘锦市磐石化工有限公司）、DMEM和新生牛血清（Gibco公司）、噻唑蓝（MTT）和胰蛋白酶（Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO，Amresco公司）、多聚甲醛（永华特种化学试剂厂）、场发射环境电子显微镜（ESEM，Model XL30FEI，美国）、电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP－OES，美国）、荧光倒置显微镜（TE2000－u，Nikon，日本）、电热恒温培养箱（DNP－9082，上海精宏实验设备有限公司）、CO2培养箱（Heraeus BB5060UV，德国）、全自动酶标仪（Thermo Multiskan－MK3，美国）。

1.2 MSM／PVA 水凝胶的制备［8］选择浓度为12%的PVA水凝胶溶液，冷却至室温后，加入MSM水溶液，MSM在水凝胶中所占比例分别为0.01%、0.10%、1.00%和10.00%，混合均匀后静止1h，除去气泡，灌入无菌干燥的玻璃平皿中，室温下静止1h，－20℃冷冻12h，室温解冻3h，如此反复循环3次，获得含有不同比例MSM的MSM／PVA水凝胶。

1.3 ESEM观察微观结构 将MSM／PVA水凝胶切割成1cm×1cm的方块，室温干燥后用真空抽干机去除材料中水分，使用液态CO2将材料脆断，喷金后，在20kV条件下观察微观结构。

1.4 脱水率测定 将 MSM／PVA水凝胶置于38℃恒温培养，脱水干燥，分别于15、45、90、135、225、315和405min测定其脱水率，每组设置7个平行样。脱水率（%）＝（1－ Wt／W0）×100%，W0为初始质量，Wt为每个时间间隔水凝胶的质量，直至恒质量。

1.5 二次溶胀率测定 将等量干燥的MSM／PVA水凝胶放入蒸馏水中，38℃恒温溶胀，分别于0.5、1.0、2.0、3.0和4.0h称质量，测定溶胀率，每组设置7个平行样。溶胀率（%）＝（Mt－Md）／Md×100%，Md为干燥水凝胶的初始质量，Mt为水凝胶t时刻的质量。

1.6 水蒸气透过率测定 将不同浓度的PVA水凝胶（8%、10%、12%和14%）及MSM／PVA水凝胶（0.01%、0.10%、1.00%和10.00%）切割成同样薄厚的薄片，放于圆柱形装有10mL蒸馏水的塑料杯杯口，杯口用密封带密封好，将塑料杯放置于37℃干燥器中。按照6、12、24和48h的时间间隔，测定质量损失的斜率，根据斜率计算出水蒸气透过率。水蒸气透过率（WVTR）（g·m－2·d－1）＝斜率×24／A，A为塑料杯口表面积。

1.7 电感耦合等离子体发射光谱（ICP）测定MSM的损失量 将MSM／PVA水凝胶（MSM含量分别为 0.01%、0.10%、1.00%和10.00%）切 割 成5mg的材料块，浸泡于PBS（pH7.2）中，密封后于37℃恒温条件下释放，分别于 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0和24.0h取出释放液，采用ICP测定水凝胶及释放液中MSM含量。

1.8 MTT法检测MSM／PVA水凝胶浸提液的细胞毒性 将不同MSM含量的MSM／PVA水凝胶剪裁成0.5cm×2.0cm的长方形块状，置于无血清的DMEM培养基中，37℃浸提48h后，过滤除菌，4℃保存备用。L929细胞以5×105mL－1接种于96孔板中，每孔100μL，加入浸提液，于37℃、5%CO2的条件下培养24h后，加入MTT溶液（5g·L－1），继续孵育4h，弃上清，每孔加入150μL DMSO，振荡溶解，于490nm波长处测定吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）＝（1－At）／A0×100%，At为实验组A值，A0为对照组A值。以细胞增殖抑制率的均值评分标准评定受试物的毒性：细胞增殖抑制率在0～20%为0级，21%～40%为1级，41%～60%为2级，61%～80%为3级，81%～100%为4级［9］。

1.9 MSM／PVA水凝胶敷料对豚鼠皮肤烫伤的修复作用 将豚鼠去除背部被毛后，用恒温电烙铁灼伤6s，制备直径为1cm的圆形烫伤。将豚鼠分为单 纯 PVA、0.01%MSM／PVA、0.10%MSM／PVA、1.00%MSM／PVA、10.00%MSM／PVA水凝胶组及对照组，每组6只。对照组处理方法：用碘酒清洗创面以及周围的皮肤，无菌纱布覆盖创面，每日换1次。其他实验组处理方法：用碘酒清洗创面以及周围的皮肤，将无菌水凝胶覆盖在创面上，每日换1次。分别于第7、15和30天采集皮肤组织样品，多聚甲醛固定，石蜡切片，HE染色观察组织学变化。

1.10 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，脱水率、二次溶胀率、水蒸气透过率、MSM含量、MSM释放率及A值均以表示，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 MSM／PVA水凝胶微观结构 MSM／PVA水凝胶具有致密的多空孔结构，电镜结果表明：孔直径大小为100～700nm，含有水分时，这些孔状结构能够储存水分，使水凝胶具有柔软紧致的状态。见图1（插页四）。

2.2 MSM／PVA水凝胶的脱水率 PVA组30、90、135、315和405min时脱水率为（15.70±1.59）%、（25.66±0.39）%、（40.83±1.38）%、（76.50±1.46）%和（91.72±0.91）%，0.01%MSM／PVA组为（15.91±0.52）%、（27.10±0.75）%、（41.87±3.06）%、（77.66±0.99）%和（91.90 ± 1.39）%；0.10%MSM／PVA组为（15.49±0.44）%、（26.15±0.66）%、（40.86±1.27）%、（76.96±0.72）%和（91.92±0.94）%；1.00%MSM／PVA组为（15.63±0.37）%、（25.51±1.26）%、（40.67±0.54）%、（76.88±0.91）%和（91.55 ± 0.24）%；10.00%MSM／PVA组为（15.45±1.19）%、（27.25±0.97）%、（40.91±1.07）%、（77.55±0.79）%和（91.64±0.77）%。同 一 时 间 内，0.01% 、0.10% 、1.00%和10.00%MSM／PVA组脱水率与PVA组比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）；0.01%、0.10%、1.00%和10.00%MSM／PVA组脱水率组间比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 MSM／PVA水凝胶的二次溶胀率 随着时间的延长，各组水凝胶的溶胀率逐渐增大，3h后，溶胀率升高至3倍。同一时间内，0.01%、0.10%、1.00%和10.00%MSM／PVA组二次溶胀率与PVA组比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）；0.01% 、0.10% 、1.00%和10.00%MSM／PVA组二次溶胀率组间比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 不同MSM含量MSM／PVA水凝胶的二次溶胀率Tab.1 Second swelling rates of MSM／PVA hydrogel with different MSM contents（n＝6，，η／%）

表1 不同MSM含量MSM／PVA水凝胶的二次溶胀率Tab.1 Second swelling rates of MSM／PVA hydrogel with different MSM contents（n＝6，，η／%）

72344.57±2.370.01%MSM 106.14±3.48162.00±1.15224.43±2.64282.57±2.64302.86±2.61312.86±3.63342.86±2.73341.00±3.560.10%MSM 106.71±3.30162.14±2.27225.14±2.89285.00±2.89305.57±1.51312.57±6.02341.00±1.73343.86±2.271.00%MSM 107.71±3.90163.00±2.16228.86±3.72283.86±3.72304.86±1.35316.86±2.41344.29±3.04345.00±3.3710.00%MSM 110.29±5.12165.43±2.07228.14±2.76281.57±2.76303.29±3.15314.57±3.603440.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 PVA 107.43±4.58162.14±2.73228.71±3.55284.57±3.55303.29±2.36314.29±1.50344.57±1.Group Second swellingrate（t／h）.29±1.60345.29±2.81

2.4 MSM／PVA水凝胶水蒸气的透过率 PVA组6、12、24和48h时透过率为（0.590±0.022）、（1.800±0.045）、（2.600±0.031）和（5.290±0.023）g·m－2·d－1，0.01%MSM／PVA组为（0.570±0.037）、（1.190±0.046）、（2.590±0.026）和（5.220±0.039）g·m－2·d－1，0.10%MSM／PVA组为（0.590±0.028）、（1.210±0.038）、（2.610 ± 0.019）和（5.280 ±0.033）g·m－2·d－1，1.00%MSM／PVA组为（0.570±0.024）、（1.210±0.034）、（2.600±0.049）和（5.310±0.026）g·m－2·d－1，10.00%MSM／PVA组为（0.580±0.028）、（1.220±0.044）、（2.600 ± 0.025）和（5.280 ±0.029）g·m－2·d－1。同 一 时 间 内，不 同 浓 度MSM／PVA组组间比较以及MSM／PVA各组与PVA组比较，水蒸气透过率差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.5 ICP测定 MSM 实际含量 0.01%、0.10%、1.00%和10.00%MSM／PVA水凝胶内 MSM实际含量 分 别 为（82.58±1.78）%、（84.38±1.15）%、（84.40±2.09）%和（85.94±0.94）%，均在80%以上，组间比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.6 MSM／PVA水凝胶中MSM的释放规律 随着时间的延长，各组MSM／PVA水凝胶中的MSM缓慢释放，且释放量逐渐增多，24h后MSM累积释放率达到55%以上，且释放量趋于稳定。同一时间内，0.01% 、0.10% 、1.00%和10.00%MSM／PVA组释放率组间比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。见图2。

图2 MSM／PVA水凝胶中MSM释放率Fig.2 Release rate of MSM in MSM／PVA hydrogel

2.7 MSM／PVA水凝胶浸提液作用后小鼠成纤维细胞L929的细胞增殖情况 PVA组A值（0.297±0.030）与对照组（0.338±0.010）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。0.01%MSM／PVA组（0.306±0.020）、0.10%MSM／PVA组（0.345±0.010）、1.00%MSM／PVA组（0.332±0.010）和10.00%MSM／PVA组（0.331±0.020）A 值分别与对照组比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）；0.10%MSM／PVA组A值与PVA组比较，差异有统计学意 义（P＜0.05）。PVA、0.01%MSM／PVA、0.10%MSM／PVA、1.00%MSM／PVA、10.00%MSM／PVA组细胞增殖抑制率分别为12.32%、9.46%、－4.63%、1.87%和7.09%。PVA和MSM／PVA各组的毒性级别均为0级。

2.8 MSM／PVA水凝胶修复豚鼠烫伤皮肤的组织学观察 烫伤部位表皮层组织缺失，真皮层毛囊结构受到破坏，烫伤模型建立区域组织红染较严重，且与周边正常组织的蓝染形成鲜明对比（图3，见插页四）。建模第7天各组豚鼠表皮结构均严重缺失，真皮层组织结构疏松，存在大量空泡状结构，胶原含量较少。第15天，对照组豚鼠表皮层缺失仍然严重，其他各组皆有较薄的表皮层出现，各组豚鼠真皮层毛囊结构以及毛细血管仍然未出现，但部分纤维组织和结缔组织已经具有形成趋势，组织结构较为致密，创面肉芽组织灶形成，成纤维细胞增殖活跃，并分泌较细小的胶原纤维填充创面。第30天，各组豚鼠受创皮肤渐渐愈合，MSM／PVA各组豚鼠表皮细胞分化良好，真皮乳头结构明显，真皮层成纤维细胞数量减少，胶原较粗大致密，排列整齐，但新生毛细血管依然少见。对照组及PVA组豚鼠表皮层出现分层结构稍晚，上皮层较薄，基底层细胞平坦，同期所形成的真皮乳头结构不明显。0.10%MSM／PVA组豚鼠愈合情况最好，1.00%和10.00%MSM组与对照组比较，也具有较好的促进创面愈合的能力（图4～9，见插页四）。

3 讨 论

本文作者选取12%PVA水凝胶作为载体加入MSM，采用反复冷冻法制备水凝胶，使水凝胶具备良好的力学性能，随着反复冷冻次数的增多，水凝胶的物理性能和机械性能不断增强。MSM／PVA水凝胶的致密多空孔结构使其具有柔软紧致的状态。MSM／PVA水凝胶脱水性能较好，MSM含量对MSM／PVA水凝胶的脱水率无显著影响。MSM／PVA水凝胶具有较高的二次溶胀率，且MSM含量对MSM／PVA水凝胶的溶胀率无显著影响。较高的溶胀率使MSM／PVA水凝胶在作为敷料使用时对伤口渗出液具有良好的吸收作用，有利于伤口愈合。MSM的缓慢释放使得MSM／PVA水凝胶在作为敷料使用时对创面愈合有较好的辅助作用，MSM含量对MSM／PVA水凝胶的MSM释放率无显著影响。PVA水凝胶浸提液对小鼠成纤维细胞L929的增殖有显著的抑制作用，不同MSM含量的MSM／PVA水凝胶浸提液对小鼠成纤维细胞L929的增殖无显著影响。0.10%、1.00%和10.00%MSM组MSM／PVA水凝胶更有利于烫伤豚鼠创面的愈合。

综上所述，以浓度为12%的PVA水凝胶为载体制备的MSM／PVA水凝胶表面微观结构、脱水性、溶胀性和MSM 释放性能较好，0.10%和1.00% 的 MSM／PVA水凝胶综合状况良好。因此，MSM／PVA水凝胶可作为优良的人工敷料，对皮肤烫伤修复有促进作用。

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