绞股蓝茶提取液中黄酮类物质测定方法改进

李 园，倪筱莉，汪东琴，朱妙琴

(浙江外国语学院科学技术学院，浙江杭州310012)

目前，植物提取物中黄酮类物质含量的测定一般采用传统的紫外分光光度法［1］、一阶分光光度法［2］、高效液相色谱［3］(High Performance Liquid Chromatography，下文简称 HPLC)法和荧光法［4］857-859等.而比色法是一些药典经常采用的测定方法.

HPLC法测定总黄酮含量需要知道所测物中最主要的物质成分，且需要相应的标准品进行对照，因而用HPLC法测定植物提取液中总黄酮含量不太容易.紫外分光光度法简单易行，对设备要求低，因此它是测定黄酮类物质含量最常用的方法.该法在测定过程中会出现一些红色絮状的螯合物，影响测定结果的稳定性，因而有必要对其进行优化.刘江 和周荣琪［5］76-78将过滤法应用到植物提取液中黄酮含量测定，提高了测量结果的稳定性，但操作步骤较麻烦.本文拟比较静置沉淀法和过滤法对绞股蓝茶提取物中黄酮类物质测定结果的影响，从而为改进植物提取液中黄酮类物质含量的测定提供依据.

1 实验部分

1.1 仪器与材料

仪器:CP1502电子天平，DKS-24电子恒温水浴锅，HY-3A多功能振荡器(江苏金坛)，UV-1900PPU紫外可见分光光度计.

材料:绞股蓝茶(湖南南山)，芦丁标准品(阿拉丁化学有限公司生产的芸香苷，含量为98%).其它试剂均为分析纯.

1.2 实验方法

1.2.1 测定原理及标准曲线的制作

硝酸铝(Al(NO3)3)显色法测定黄酮类物质含量的原理为:在中性或弱碱性及NaNO2存在的条件下，黄酮类化合物与铝盐生成配合物，加入NaOH溶液后显红橙色，在510nm波长处有吸收峰且符合比尔定律，以芦丁标准品定量.先用NaNO2还原黄酮，然后加入Al(NO3)3络合，最后加NaOH溶液使黄酮类化合物开环，生成2'-羟基查耳酮而显色.显色原理发生在黄酮醇类成分邻位无取代的邻二酚羟基部位，不具有邻位无取代邻二酚羟基的黄酮醇类成分加入上述试剂时不显色［6］.

［5］的方法，用10mL移液管准确吸取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL 的11.5mg/100mL芦丁标准液分别置于25mL的比色管中.用50%的乙醇溶液补充至约5mL，分别加5%的NaNO2溶液0.3mL，摇匀，放置6min;再加10%的Al(NO3)3溶液0.3mL，摇匀，放置6min，最后加入1mol/L的NaOH溶液4mL，用水稀释到10mL，放置20min，在510nm处测定过滤前后吸光度，以吸光度A为纵坐标，浓度c(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线.

1.2.2 绞股蓝茶提取物中黄酮类物质的提取与测定

参考文献［4］方法，分别称取2.0g绞股蓝茶于锥形瓶中，加入10mL石油醚在200Hz频率下振荡30min脱脂、过滤.在滤渣中加入50%的乙醇30mL，振荡30min，过滤，收集滤液于100mL的容量瓶中.重复此操作3次，将滤液合并于100mL的容量瓶中，用50%的乙醇定容至100mL备用.按照1.2.1所述方法测定绞股蓝茶提取物中黄酮类物质含量.

2 结果与讨论

2.1 过滤前后芦丁标准曲线测定

按1.2.1方法，测得芦丁标准曲线数据见表1.

表1 芦丁浓度与吸光度之间的关系

过滤前标准曲线的回归方程:C1=1.0080A1－0.0066，相关系数为R2=0.9995，式中C1为芦丁浓度(mg/mL)，A1为吸光度.过滤后的回归方程:C2=1.2268A2－0.0054，相关系数R2=0.9996.从表1数据知，滤纸的吸附作用对结果有一定影响，芦丁含量的测定结果比过滤前偏低.

2.2 重复性和准确性的检验

用过滤法分别测定了绞股蓝茶提取物液中黄酮类物质的含量，结果见表2.

表2 过滤法测定绞股蓝茶提取物中类物质含量(mg/mL)

由表2可知，测定结果重现性较好，虽然表格中的数据浓度非常低，但是变异系数也是非常低的，基本能够满足定量测定的要求.

另外，分别吸取了1.5mL、2.5mL、3.5mL和4.5mL芦丁标准液加入25mL比色管中，依照过滤法标准曲线的测定方法，测定了其试液的吸光度，并与按回归方程:C2=1.2268A2－0.0054得到的计算值一同列入表3中.

表3 标准曲线的准确度检验

由表3可知，过滤法得到的标准曲线的准确度较高，能够满足实际的需要.2.

2.3 静置沉淀法对芦丁测定的影响

在实验过程中，发现采用过滤法测定吸光度的工作量较大，所耗费的时间较长.观察到实验过程中加入NaOH，静置约30min，螯合物会沉淀于比色管底部这一现象.因而实验中直接用吸管吸取上层清液来测定吸光度.最后将待测液静置30min，重新测定各个浓度试液的吸光度，结果见表4.

表4 芦丁浓度与吸光度之间的关系

表4数据表明:采用静置沉淀法，消除了过滤法中滤纸的吸附作用，测定结果更加准确.根据静置沉淀的吸光度值对应芦丁浓度可以得一条标准曲线，线性关系良好(见图1).回归方程为:C3=1.2150A3－0.0060，相关系数 R2=0.9995.

图1 静置沉淀法得到的芦丁标准曲线

2.4 过滤法和静置沉淀法测定结果比较

实验采用过滤法和静置沉淀法分别测定了两份绞股蓝茶提取物中黄酮类物质含量，结果见表5.

表5 过滤法和静置沉淀法测定结果比较

从表5中数据可以看出，过滤法测定结果比静置沉淀法测得结果稍低，可能的原因是滤纸的吸附作用.

3 小结

(1)过滤法和静置沉淀法应用于紫外分光光度法测定绞股蓝茶提取液中黄酮类物质含量，可以提高测定的准确度，稳定性、重现性良好.

(2)与静置沉淀法比较，过滤法工作量较大，测定结果偏低.而静置沉淀法应用于紫外分光光度法测定绞股蓝茶提取液中的黄酮类物质含量，操作简单、易行，准确度更高、稳定性更好.

参考文献:

［1］侯冬岩，回瑞华，关崇新.绞股蓝中总黄酮的分析研究［J］.沈阳师范学院学报:自然科学版，2003，22(6):39-42.

［2］李小娟.一阶导数分光光度法测定蜂胶保健品中黄酮的探讨［J］.光谱实验室，2002，19(6):774-776.

［3］Cristea D，Bareau I，Vilarem G.Identification and quantitative HPLC analysis of the main flavonoids present in weld(Reseda luteola L.)［J］.Dyes and Pigments，2003，57(3):267-272.

［4］许刚，张虹，胡剑.竹叶中黄酮提取方法的研究［J］.分析化学，2002，28(7).

［5］刘江 ，周荣琪.竹叶提取物总黄酮含量测定方法改进［J］.食品科技，2005(7).

［6］张航.云啤2号X大粒麦F2群体籽粒功能成分的遗传及其QTL分析［D］.昆明:云南大学，2012:17.