离子强度对N-十四烷基-N-羟乙基-N，N-二甲基溴化铵与牛血清白蛋白结合作用的影响

沈颖颖，邵 爽

(浙江外国语学院科学技术学院，浙江杭州310012)

蛋白质-表面活性剂混合体系广泛应用于药物、化妆品、生物及食品等领域［1-2］.表面活性剂与蛋白质等生物大分子相互作用的研究一直是人们十分感兴趣的课题［3-8］，其主要包括表面活性剂-蛋白质复合物结构、蛋白质结构变化以及相互作用机制;表面活性剂结构、浓度、溶剂、pH值、离子强度和温度等因素对相互作用的影响等.

离子强度对小分子与生物大分子相互作用存在一定影响.阳离子表面活性剂与血清蛋白通过静电引力和疏水方式作用，且静电作用占主导地位，离子强度的变化会直接影响二者作用［9］.离子强度的变化对牛血清蛋白的平衡吸附容量有很大的影响［10］，此外离子强度对BSA的荧光强度影响显著［11］.

本文在已有研究工作［12-14］的基础上，通过改变NaCl浓度改变体系的离子强度，用荧光光谱法考察离子强度对新型季铵盐类离子型表面活性剂N-十四烷基-N-羟乙基-N，N-二甲基溴化铵(THDAB)与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的影响，运用理论模型处理实验数据得到猝灭常数、结合常数、平均结合位点数等重要相互作用参数，从而进一步阐明表面活性剂与BSA的结合机制及作用规律.

1 仪器和试剂

1.1 仪器

FP-6200型荧光分光光度计(日本Jasco公司);Finnpipette移液器(上海雷勃分析仪器有限公司)5～50μL，20～200 μL;TB-85型超级恒温器(日本Shimadzu公司);UPWS-10T超纯水器(杭州永洁达净化科技有限公司);AB265-S电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司).

1.2 试剂及配制

BSA购于上海伯奥生物科技有限公司，氮含量≥13.5%;N-十四烷基-N-羟乙基-N，N-二甲基溴化铵(THDAB)为浙江大学化学系提供(纯度≥99.9%);三羟基氨基甲烷(Tris)(纯度≥99.9%)、HCl(浓度为36%～38%)、NaCl(含量≥99.5%)，三者均为分析纯;实验用水为超纯水.

配制 pH=7.1 的 Tris-HCl缓冲溶液(分别含0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mol·L－1的 NaCl以改变离子强度)，分别用上述不同离子强度的 Tris-HCl缓冲溶液配制4.0μmol·L－1BSA 溶液及1.0×10－3mol·L－1THDAB溶液备用.

1.3 实验方法

BSA荧光激发和发射光谱测定:用移液器移取一定浓度BSA溶液于石英比色皿中，设置发射波长为280nm，狭缝宽度为5nm，在298K下扫描250～350 nm的荧光激发光谱，测得其最大激发波长;并在其最大激发波长处，同样条件下扫描其290～410nm的荧光发射光谱，得到最大发射波长.

THDAB对BSA的荧光猝灭光谱:分别移取含不同NaCl浓度的BSA溶液与不同浓度的THDAB溶液于容量瓶中，混均、恒温至298K，设置荧光激发和发射最大宽度均为5nm，最大激发波长为282nm，测定其荧光发射光谱，记录最大荧光强度.

2 结果与讨论

2.1 BSA的荧光激发和发射光谱

分子中色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)等氨基酸残基可吸收270～300nm紫外光产生荧光，从而成为内源性荧光物质.BSA的内源荧光主要由Trp产生，其荧光最大激发波长在282nm附近.实验测得4μmol·L－1BSA的荧光激发和发射光谱示于图1，得到BSA的最大激发波长为282nm，在此激发波长下其发射光谱的最大波长为345nm.

图1 BSA的激发和发射光谱

2.2 猝灭光谱

当NaCl浓度为0.2mol·L－1时，THDAB-BSA的荧光猝灭光谱见图2，其它不同NaCl浓度的猝灭光谱图类似.结果表明，随着加入的表面活性剂量增加，BSA发射光谱的荧光强度减小，产生荧光猝灭.

2.3 Stern-Volmer猝灭常数及猝灭机制

对于低浓度区，表面活性剂对BSA荧光猝灭效应基本符合Stern-Volmer方程［15］:

式中I0为未加入猝灭剂时荧光物质的荧光强度，I为猝灭剂浓度等于［D］时荧光物质的荧光强度;Kq为双分子猝灭过程的速率常数;τ0为没有猝灭剂存在下荧光分子的平均寿命(生物大分子的τ0约为10-8s)，Ksv称为 Stern-Volmer猝灭常数.

图2 THDAB浓度对BSA的荧光强度的影响

在THDAB浓度低于100μmol·L－1范围内，以最大发射波长345nm处BSA荧光强度按式(1)将I0/I对［NaCl］进行线性回归，得到温度为298K时THDAB-BSA体系的Stern-Volmer方程式猝灭常数Ksv和相应线性相关系数R2，结果列于表1.

表1 THDAB-BSA 体系的猝灭常数 Ksv及线性相关系数 R2(T=298K，pH=7.1，［BSA］=4μmol·L－1)

由表1可知，在THDAB-BSA体系中，随着NaCl浓度的增大，其Stern-Volmer猝灭常数Ksv增大;双分子猝灭过程的速率常数Kq均大于生物分子的最大扩散碰撞猝灭常数(2.0×1010L·mol－1·s－1)，这说明THDAB对BSA的荧光猝灭机制呈现静态猝灭特征.

2.4 结合常数及离子强度对结合常数的影响

小分子对蛋白质荧光的静态猝灭可用位点模型来处理［16］:

式中I，I0分别是有和无猝灭剂时的荧光强度，KA是BSA与猝灭剂之间的结合常数，［D］是猝灭剂的平衡浓度，n是结合位点数.由此方程以log［(I0－I)/I］对log［D］作图，由直线斜率求得不同温度下猝灭剂与BSA的结合位点数n，通过截距可以求出结合常数KA值.

将本实验得到的猝灭光谱数据，按式(2)进行线性回归，得到不同NaCl浓度下THDAD与BSA结合反应的结合常数KA、结合位点数n及相关系数R2(见表2).

表2 THDAB与BSA结合反应的结合常数KA、结合位点数n及相关系数R2(T=298K pH=7.1)

为了便于分析离子强度对THDAB与BSA结合作用的影响，将不同NaCl浓度下THDAB对BSA的荧光猝灭强度与［NaCl］作图(见图3)，同时将按上述模型拟合得到的KA与［NaCl］关系作图(见图4).

图3 不同［NaCl］时THDAB-BSA的猝灭光谱

图4 结合常数KA与NaCl浓度关系

结果表明，离子强度对THDAB与BSA结合作用有较大影响，主要表现在离子强度的增加导致:(1)THDAB对BSA的荧光猝灭强度减小(见图3);(2)THDAB与BSA的结合作用减小、结合位点数下降(见图4).产生这一结果的主要原因可归结为以下两个方面:随着离子强度增加，盐离子强烈地屏蔽蛋白质分子和结合分子之间的静电引力，使BSA分子难以在介质表面上吸附和重排，表现为结合能力减弱［17］;NaCl的加入，造成较高的离子氛，降低了两者的亲和力［18］.本实验的结果与文献报道一致.

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