正交设计－重复试验法优选蒙药沙棘清喉颗粒的提取工艺

杨万政 蒲维维 白音夫

(1.中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081 2.中国气象局北京城市气象研究所，北京 100089 3.内蒙古自治区中蒙医研究所，内蒙古 呼和浩特 010020)

蒙药沙棘清喉颗粒由金银花、牛蒡子、玄参、沙棘等7味中药组成，具有清透热邪、利咽散结之功效。根据处方药味性质及药理作用的研究，本文选用绿原酸、牛蒡子苷和总黄酮作为评价指标，对清喉颗粒的提取工艺进行正交优化试验。药理实验表明，绿原酸具有利胆保肝、抗菌、抗病毒、降压、增高白血球及兴奋中枢神经系统等多种药理作用［1－3］;牛蒡子苷具有钙拮抗样作用，能抗肾炎，改善血清生化指标和抗肿瘤作用以及扩张血管等作用［4］;沙棘总黄酮(THF)能增强小鼠特异和非特异免疫功能，提高耐缺氧能力、降低血清胆固醇、抑制血小板聚集、抗溃疡、抗炎、抗过敏、抗氧化、抗衰老、抗辐射和抗菌、抗病毒及增强免疫等广泛的药理功效［5］。

本文采用L9(34)正交实验对沙棘清喉颗粒的制备工艺条件进行优选，同时由于正交表中各列因素水平均已排满，不需使用更大的正交表。故作重复试验，估算试验误差，进行方差分析，以此确定各因素的显著性水平。从而得出清喉颗粒的最佳工艺参数。

1 仪器与材料

1.1 仪器:LC10－ADvp型高效液相色谱仪;V－550紫外可见分光光度计;Millipore纯水机;Adventurer电子分析天平。

1.2 药材:金银花、薄荷、牛蒡子、玄参、芦根购于北京同仁堂药店;沙棘购于水利部高原圣果有限公司;余甘子购于西藏药厂。

1.3 标准品:绿原酸标准品(批号110753－200413)、牛蒡子苷标准品(批号110819－200404)、芦丁标准品(100080－200306)购于中国药品生物制品检定所。

1.4 试剂:甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 提取工艺筛选:按处方比例，称取各药味，加溶剂浸泡，提取工艺筛选得到样品溶液。以L9(34)正交表安排实验。考察因素见表1。

综合评分:因金银花为方中君药，绿原酸为金银花的主要有效成分，具有较高的药理活性，故绿原酸为重要指标之一，权重系数定为0.4。牛蒡子苷为牛蒡子的有效成分，且牛蒡子为方中臣药，因此，牛蒡子苷作为评价提取工艺的一个指标，权重系数定为0.3。作为大类成分间接控制的一个指标，总黄酮的权重系数定为0.3。

表1 因素与水平

2.2 含量测定

2.2.1 绿原酸的含量测定:色谱条件:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;检测波长327nm;流动相乙腈－水(20:80)，磷酸调节pH=4;流速1mL/min;柱温30℃。

分别准确移取浓度为8.5μg·mL－1的绿原酸对照品溶液0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL 于 10mL 容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，各取20μL稀释液进样，在上述色谱条件下测定峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，直线回归得标准曲线方程为:y=54645x－122210，R2=0.9997。结果表明绿原酸进样浓度在8.5～68μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

取样品溶液1mL，用50%甲醇定容至10mL，过微孔滤膜，所得滤液为供试品溶液。在上述色谱条件下，取20μl进样测定峰面积。由标准曲线方程计算样品溶液中绿原酸的含量。

2.2.2 牛蒡子苷的含量测定:色谱条件:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相乙腈－水(30:70);流速1mL/min;检测波长278nm;柱温30℃。

分别准确移取浓度为 8.7μg·mL－1对照品溶液 0.25mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL 于 10mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，各取20μL稀释液进样，在上述色谱条件下测定峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，直线回归得标准曲线方程为:y=11918x－2845.6，R2=0.9996。结果表明牛蒡子苷进样浓度在2.175～69.600μg·mL－1范围内与峰面积线性关系良好。

取样品溶液1mL，用甲醇定容至10mL，过微孔滤膜，所得滤液为供试品溶液。在上述色谱条件下，取20μL进样测定峰面积。由标准曲线方程计算样品溶液中牛蒡子苷的含量。

2.2.3 总黄酮的含量测定:精确称取6.1mg芦丁标准品，用甲醇溶解，定容到250mL容量瓶中，备用。分别准确移取以上述对照品溶液 5mL、7mL、9mL、11mL、13mL、15mL 于25mL容量瓶中，加5%AlCl3甲醇溶液1mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，静置10min。

以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标，直线回归得标准曲线方程为:y=0.0522x+0.0275，R2=0.9999。结果表明总黄酮浓度在 4.880 ～14.640μg·mL－1范围内与吸光度线性关系良好。

取1mL样品溶液于25mL容量瓶中，加入1mL5%AlCl3甲醇溶液，再加入甲醇定容，静置10min，进行测定，以标准曲线方程计算样品含量。

2.3 正交实验结果:根据以上正交因素的因素－水平表，按四因素三水平正交实验进行9次实验，正交实验安排和结果见表2。

表2 L9(34)正交实验结果

表3 方差分析

2.3.2 结果分析:为避免实验误差的干扰，对正交实验结果进行了极差分析。结果见表。因为极差R的大小显示影响因素的主次，由R值大小可见，不同因素对有效成分提取量的影响程度不同，表2表明影响因素顺序为D(提取次数)＞A(乙醇浓度)＞C(提取时间)＞B(料液比)。

提取次数对有效成分得率影响最大，提取次数为3次时提取效果最好;提取时间的影响次之，提取时间为1.5h时，有效成分得率最高;乙醇浓度则以70%为最佳;料液比对提取的影响最小，从极差分析可以看出，料液比达到1:10，有效成分得率较其它条件时要高。所以在生产时可以采用 A2B2C2D3，即工艺条件为:70%乙醇、浸泡 2h、1:10、1.5h/次，共提取3次。

2.4 重复验证试验:为进一步考察上述优选工艺条件的稳定性，按最佳工艺条件A2B2C2D3进行重复2次提取，对最佳提取工艺进行验证。实验结果见表4。绿原酸、总黄酮和牛蒡子苷得率的RSD值均小于3%，从而说明该工艺合理可行。

表4 提取工艺验证试验数据

3 结论

复方提取工艺考察了醇浓度、料液比、提取时间和提取次数等因素，选取了有显著影响的因素进行正交实验，实验结果表明，影响程度为:提取次数＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比。

最佳复方提取工艺为:药材饮片先粉碎成粗粉，加入10倍量70%乙醇进行提取，每次提取1.5h，共提取3次。在该条件下各指标含量较高，说明药材提取利用较完全，并经重复试验验证，该工艺稳定可行。

［1］刘军海，裘爱泳.杜仲叶绿原酸提取纯化工艺的研究［J］.中药材，2004，12

［2］阴键编.中药现代研究与临床应用(2)［M］.北京:中医古籍出版社，1995:66

［3］Abraham S K，Sarma L，Kesavan P C.Protective effects of chlorogenic acid，curumin and a a－carotene against r－radiation － induced in vivo chromosomal damage［J］.Mutation Research，1993，303:109 ～112

［4］王本祥.现代中药药理与临床［M］.天津:天津科技翻译出版社，2004

［5］黄朗，刘常伍，范维衡等.醋柳总黄酮防治冠心病药理基础研究［J］.华西药学杂志，1986，1(3):163～167