反相高效液相色谱法测定苜蓿中绿原酸的含量

古丽巴哈尔·达吾提 陈 娟 王 娟 买买提·吐尔逊

(喀什师范学院化学与环境科学系，新疆 喀什 844000)

苜蓿是苜蓿属(Medicago)植物的通称，是一种多年生开花植物。苜蓿原产伊朗，在西汉从西域引进，已有2000多年的栽培历史，是分布最广的栽培牧草。苜蓿中最著名的是作为牧草的紫花苜蓿(Medicago sativa L.)。苜蓿不仅可用于家畜饲养，也是人类最古老的食物之一，其含有大量的粗蛋白质、多种维生素、矿物质及类黄酮素成分［1］。在新疆用苜蓿做的馄饨是春天里的第一道美食。维吾尔等少数民族有一个风俗，不管是城市还是农村，开春后每家每户都要吃用苜蓿包的馄饨。迎接春天的到来，蕴含报春之意。吃苜蓿馄饨已成为新疆各族群众普遍喜好的春季美食之一，主要食用苜蓿早春返青时的嫩苜蓿。除此之外，维医使用苜蓿嫩叶治疗肠胃道功能失调，改善糖尿病、高血压等慢性病。随着人民生活水平的提高，绿色食品越来越受到广大群众的青睐。由于苜蓿中富有各种营养成分，已成为新疆各族群众在春季里的美食。据相关文献报道，已开发出了以苜蓿为原料的食品添加剂和饮料［2］。本实验采用反相高效液相色谱－二极管阵列检测法，对苜蓿中的绿原酸进行含量测定，为苜蓿的质量评价提供实验依据。

1 仪器与试药

岛津LC－20AT高效液相色谱仪(配有SPD－M20A二极管阵列检测器，DGU－20A5在线脱气机，LC－solution工作站);KQ3200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);XA－1型多功能粉碎机(江苏姜堰市分析仪器厂);ZK－82B真空干燥箱(上海市实验仪器总厂);赛多利斯BS224S型电子天平(德国)。

绿原酸对照品(编号:110753－200413，中国药品生物制品检定所)，甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水其它试剂均为分析纯。苜蓿嫩草，2013年分2月分别采集于喀什地区疏附县，疏勒县。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液:准确称取绿原酸标准品5.0mg，置于50mL容量瓶中加甲醇制成每1mL含绿原酸100μg的贮备溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液:取新鲜苜蓿样品用去离子水洗净，置于真空干燥箱内，在80℃下真空干燥8h，经粉碎后精密称取2.0g，用甲醇分两次超声处理40min，常压过滤，取滤液置圆底烧瓶中，旋转蒸发浓缩，转移至25mL容量瓶中用甲醇定容。

2.2 色谱条件:色谱柱为安捷伦HC－C18柱(250mm×4.6mm，5?μm)柱，流动相为乙腈 －0.4%磷酸=13:87(V/V)，流速为 1.0mL/min，检测波长为 327nm［4］，进样量为 20μL。在本文色谱条件下，取供试品溶液、绿原酸对照品溶液各20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图(见图A，B)。

2.3 线性关系试验:精密吸取对照品溶液 0.5，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL 分别置于50mL(1 支)，10mL(5 支)容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。吸取各对照品溶液20μL，在上述色谱条件下依次进样，测定峰面积。以进样量X为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标进行线性回归，得回归方程为:Y=21036X+4821.8，r=0.9997，线性范围为 1.0 ～40μg·mL－1。

2.4 精密度试验:精密吸取对照品溶液1.0mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。精密吸取对照品液20μL，照2.2项下进样，连续进样5次，对照品绿原酸峰面积的RSD=1.02%。

2.5 稳定性试验:取样品溶液，分别在 0，2，4，6，8h 在上述色谱条件下测一次，进样量为20μL，结果绿原酸的峰面积的RSD=0.98%。表明样品在8h内稳定。

2.6 重复性试验:精密称取苜蓿粉末2.0g，按上述供试品溶液的制备方法和测定条件，重复测定5份，结果绿原酸峰面积的RSD=1.21%。

2.7 回收率试验:准确称取已知绿原酸含量的苜蓿粉末2.0g(5 份)，精密称定，分别精密加入 20μg·mL－1对照品溶液1mL，按供试品溶液制备和测定方法检测，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果

2.8 样品含量测定结果:精密吸取苜蓿样品溶液20μL进样，并按1.2色谱条件进行平行5次测定，外标法计算样品中绿原酸的含量。测定结果为9.2mg%(n=5，RSD=1.05%)。

图1 绿原酸标准品及苜蓿样品HPLC色谱图。

3 讨论

苜蓿作为牧草作物当中营养价值最高的一种草本植物，在少数民族饮食文化及维医中具有特殊地位。苜蓿嫩叶化学成分较复杂，本实验采用浸泡、索氏提取、超声等提取方法对绿原酸进行提取，通过色谱数据可以发现，浸泡4h后，分2次超声40min可以得到较好的提取效率，即峰面积最大［3］。本实验以不同比例的甲醇/乙酸、甲醇/磷酸、乙腈/乙酸、乙腈/0.4%磷酸作为流动相，最后确定用乙腈/0.4%磷酸(13:87)为流动相，在此条件下，样品溶液中的绿原酸达到了较好的分离效果。本实验所使用的仪器配有二极管阵列检测器，因此，根据色谱三维图可以发现，当波长为327nm时，峰型较好，并且干扰组分的峰面积减小，绿原酸的色谱峰可以避免其他成分色谱峰的干扰［4，5］。通过实验得出苜蓿嫩叶中绿原酸的含量为9.2mg%。同时采用的方法简单，提取效率高，为苜蓿中绿原酸的提取和含量测定提供了一种简便快捷手段。

［1］王艳萍，祝美云，王成章，等.苜蓿在食品中的应用［J］.食品研究与开发，2006.27(3):73－75

［2］乔秀红.苜蓿汁饮料的研制［J］.中国食物与营养，2002，4:41 －42

［3］林丹，赵国玲，刘佳佳.金银花不同提取方法的绿原酸比较研究［J］.天然产物研究与开发，2002，15(2):124－126

［4］李存满，李兰芳，张勤增.高效液相色谱法测定苜蓿中莒蓿素的含量［J］.药物分析杂志，2006，26(4):494－496

［5］赵英，周凯，张静.HPLC法测定牛蒡子中绿原酸的含量［J］.中国民族医药杂志，2012，9:44－46