流动注射化学发光分析法测定片剂甲氧氯普胺

熊海涛，唐志华，聂 峰，郑行望

(1.陕西理工学院 化学学院，陕西 汉中 723001;2.陕西师范大学 化学与材料科学学院，陕西 西安 710062)

甲氧氯普胺(Metoclopramide，4-氨基-5氯-N-(二乙胺基乙基)-2-甲氧基-苯甲酰胺，MCPM)，又名胃复安，是中枢性止吐药和胃肠动力药，其过量使用会导致人体肌震颤、头向后倾、斜颈、阵发性双眼向上注视、发音困难、共济失调等症状及机体的不随意和重复性运动［1］。因此，建立快速、准确测定甲氧氯普胺含量的分析方法具有重要的现实意义。目前，测定MCPM的方法主要有荧光分析法［2］、分光光度法［3－4］、电化学法［5－7］、高效液相色谱法［8］、电致化学发光分析法等［1，9］。但上述方法存在灵敏度不高，或操作复杂，或仪器试剂昂贵等不足。

化学发光分析法作为一种灵敏度高、分析速度快、成本低、线性范围宽、仪器设备简单的分析方法发展迅速，且已应用于药物分析、免疫分析、矿物分析、环境监测、临床医药、生命科学等方面［10］。而流动注射分析是一种易实现现场与邻近实验室联线的自动分析系统，具有装置小型化、操作简单、自动化程度高、分析速度快、分析结果重现性良好、所需试剂量少的特点。因此，流动注射化学发光分析法除了拥有化学发光分析法的优点外，还具有流动注射技术的优点，二者的联合使用可使其分析特性得到进一步的提高［11］。目前，应用化学发光分析法测定 MCPM的文献也有报道［12－16］。如吴志皓课题组［12］与范顺利［13］等基于甲醛对高锰酸钾氧化甲氧氯普胺的化学发光反应有很强的增敏作用，建立了流动注射化学发光法测定甲氧氯普胺的新方法，其检出限分别为0.1、0.2 mg/L，但测定过程中均使用了致癌物质甲醛，其使用受到一定限制。刘伟等［14］利用碱性条件下甲氧氯普胺能够与鲁米诺和亚铁氰化钾产生化学发光的现象，结合流动注射技术，对胃复安片剂中的甲氧氯普胺进行了测定，方法的线性范围较前两者宽，检出限为0.04 μg/mL，但分析特性仍不令人满意。另外，Al－Arfaj［15］与石文兵等［16］分别使用三联吡啶钌与鲁米诺作为发光试剂，并结合流动注射技术建立了化学发光法测定甲氧氯普胺的新方法，其线性范围更宽，检出限更低(分别达1.0、0.05 μg/L)。但前者使用的发光试剂三联吡啶钌比较昂贵，而后者不仅使用比较昂贵的氯金酸，而且利用逆胶束介导法(包括萃取过程)使得测定速度较慢，因而这两种方法不适合用于临床检验。目前，一种试剂廉价、操作方便、快速且环保的NaIO4－H2O2体系已成功地用于一些自身具有荧光或多酚类物质(包括临床药物)的化学发光检测［17－21］。如聂峰等利用NaIO4－H2O2－H3PO4化学发光体系，并结合流动注射技术，实现了对尿液肾上腺素以及多种有机药物(如土霉素、林可霉素、盐酸小檗碱、安替比林、维生素B2、潘生丁、多巴酚丁氨、马来酸麦角新碱、肾上腺色腙、肾上腺素、异丙肾上腺素、西洋参总皂甙等)的快速分析［18－19］。徐伟民等则基于中性介质中硒对NaIO4－H2O2体系弱化学发光的增敏作用，建立了一种简易、快速检测天然水中痕量硒的流动注射化学发光法［20］。但至今未见利用NaIO4－H2O2－H3PO4化学发光体系测定MCPM的文献报道。

本文研究发现甲氧氯普胺在酸性介质中，可以使NaIO4－H2O2的弱化学发光得到加强，并且溴化钠的存在可以明显增大该发光的强度，据此建立了一种简单、快速测定甲氧氯普胺的化学发光新方法。该方法灵敏度较高、分析速度快、操作简便。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

IFFM－D流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈电子科技公司)，IFFS－A型多功能化学发光检测器(西安瑞迈电子科技公司)。所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

甲氧氯普胺标准贮备液(1.00×10－2g/L):在0.10 mol/L磷酸介质中，用甲氧氯普胺对照品(中国药品生物制品检定所)配制，放置过夜后使用。

高碘酸钠贮备液(0.05 mol/L):使用前现配，准确称取NaIO4溶于水中，并定容于棕色容量瓶中;H2O2溶液(30%);溴化钠溶液(0.05 mol/L)。

1.2 实验方法

流动注射化学发光仪流路图如图1所示。首先，传送试样溶液流过并使其完全充满管路，然后传送NaIO4、H2O2、H3PO4至管路，此时试样和体系在 V点混合发生化学发光反应，NaIO4－H2O2混合液流经光电倍增管时体系的发光强度输出为 I，同时测定试剂空白的发光强度I0，以相对发光强度ΔI(I－I0)对甲氧氯普胺标准溶液的浓度作图，从而进行定量分析。

图1 流动注射化学发光分析流程图Fig.1 Schematic diagram of flow injection CL system

2 结果与讨论

2.1 仪器参数的选择

本文采用浓度为1.00×10－7g/mL的甲氧氯普胺标准液进行考察，同时对流路和光电倍增管的负高压进行优化。

甲氧氯普胺在NaIO4－H2O2体系中产生化学发光反应，先以2.00 mol/L H3PO4为介质进行流路设计，分别试验了多种组合，以获得最强最稳定的化学发光信号和最高的灵敏度，当采用如图1所示的流路时，得到的相对发光强度最大，且信号稳定，故选择此流路进行分析。

由于甲氧氯普胺在NaIO4－H2O2体系中能产生快速化学发光反应，因此设计了较短的反应管长(35.0 mm)。考察了光电倍增管的负高压在－600～－900 V范围内对体系化学发光信号的影响，结果显示，负高压过低时，化学发光强度低，灵敏度不高;而负高压过高，空白信号与样品信号均会增强，导致信噪比下降，同时还会使信号不稳定。综合灵敏度和稳定性，选择最佳负高压为－800 V。

图2 高碘酸钠浓度对相对化学发光强度的影响Fig.2 Effect of sodium periodate concentration on the relative CL intensity

2.2 实验条件的优化

2.2.1 反应介质及其浓度的确定 分别考察了 H2O、HAc、HCl、H2SO4、H3PO4为反应介质时的发光强度，当介质浓度均为1 mol/L时，NaIO4(0.10 mol/L)－H2O2(3%)－甲氧氯普胺(1.00 ×10－7g/mL)－NaBr(0.03 mol/L)体系在上述几种介质中的相对发光强度分别为11、17、34、60、88，所以实验选择H3PO4作为反应介质。分别考察了H3PO4溶液浓度为0.50～3.00 mol/L时的发光强度，结果表明:化学发光强度随着H3PO4浓度的增大而增大，当H3PO4溶液的浓度达到1.60 mol/L时发光强度最大，之后继续增大浓度则发光强度减小，所以实验选择1.60 mol/L H3PO4作为最佳反应介质。

图3 H2O2浓度对相对化学发光强度的影响Fig.3 Effect of hydrogen peroxide concentration on the relative CL intensity

2.2.2 NaIO4浓度的选择 NaIO4是该化学发光体系的重要氧化剂，主要用来氧化甲氧氯普胺。分别考察了NaIO4溶液浓度为0.05～0.30 mol/L时的发光强度(如图2所示)，发现发光强度随着NaIO4浓度的增大而增大，当浓度到达0.20 mol/L时达到最大，此后继续增大NaIO4浓度发光强度反而降低，最终选择NaIO4的浓度为0.20 mol/L。

2.2.3 H2O2浓度的选择 考察了H2O2浓度在0.4%～3.0%范围内的影响(如图3所示)，结果表明:发光强度随着H2O2浓度的增大而增大，当浓度达到1.0% 时发光强度达到最大，之后则一直减小，因此实验选择H2O2的浓度为1.0%。

2.2.4 溴化钠溶液浓度的选择 研究发现，在无溴化钠存在时，NaIO4－H2O2－甲氧氯普胺反应的发光信号较弱，但加入少量的溴化钠可极大增强发光信号，表明溴化钠对该发光反应体系具有较强的增敏作用(如图4所示)。进一步研究发现:发光强度先随着 NaBr浓度的增大而增大，当浓度到达0.04 mol/L时发光强度达到最大，因此实验选择NaBr的浓度为0.04 mol/L。

图4 溴化钠浓度对相对化学发光强度的影响Fig.4 Effect of sodium bromide concentration on the relative CL intensity

2.3 标准工作曲线、检出限与精密度

在最佳实验条件下，MCPM浓度在1.00×10－9～1.20×10－6g/mL范围内与相对发光强度ΔI(扣除空白)呈良好的线性关系，其线性方程为 ΔI=318.37ρ+83.721，其中ΔI是相对化学发光强度，ρ是甲氧氯普胺的质量浓度(mg/L)，相关系数r=0.999 1。对1.00×10－7g/mL的甲氧氯普胺溶液进行11次平行测定，得到相对标准偏差为2.5%。按照IUPAC建议计算出方法的检出限为3.5×10－10g/mL。

2.4 干扰实验

在最佳实验条件下，测定相对误差在±5%以内时，考察了常见的干扰物对测定1.00×10－7g/mL MCPM时的干扰情况，其允许的倍数为:K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Ba2+(3 000倍);、Zn2+(2 000倍);柠檬酸、酒石酸(1 000倍);Br－、Pb2+、Cu2+、Fe3+(500倍);淀粉、葡萄糖(300倍);苯甲酸(100倍);SCN－(50倍);草酸根(20倍);I－(10倍);SO23－(5倍);抗坏血酸(2倍);联苯三酚(1倍)。

2.5 实际样品的分析

2.5.1 片剂中甲氧氯普胺分析 称取甲氧氯普胺片剂数片，将其研细、混匀。准确称量后用水溶解、过滤、定容，按照实验方法进行测定，并与标准方法(药典法)相对照［21］。结果显示，本方法与标准方法测定结果较为一致。同时做加标回收试验，测得回收率为98%～100%，相对标准偏差为2.6%～3.1%(见表 1)。

表1 甲氧氯普胺的回收率与相对标准偏差Table 1 Recoveries and RSDs of metoclopramide

2.5.2 尿液中甲氧氯普胺的分析 由于尿液中通常含有强还原性物质(如尿酸和Vc)，会对甲氧氯普胺测定产生一定的干扰，因此需要对其进行预处理。本文在收集的尿液中先加入一定量的PbO2粉末，搅拌反应15 min左右以消除强还原性物质的干扰。然后对尿液进行过滤以除去杂质和过量的PbO2粉末。再分别准确移取2.00×10－3g/mL甲氧氯普胺标准溶液1.00 mL(1#)、5.00 mL(2#)于两份过滤后的尿样中。各准确移取0.50 mL该溶液，置于两只250 mL容量瓶中，用水稀释至刻度并摇匀，对其做加标回收试验(结果见表2)。从表2可以看出，方法有较好的重现性，回收率为96%～98%，故此法可用于尿样中甲氧氯普胺的测定。

表2 尿样中甲氧氯普胺的回收率测定结果Table 2 Results for the determination of metoclopramide recovery in spiked urine

2.6 化学发光机理推测

关于酸性介质中，NaIO4氧化H2O2产生微弱的化学发光，这一发光机理已得到详尽的探讨。发光体(激发体)被认为是该氧化还原反应产生能量较高的氧分子(激发态氧，即单线态氧或1O2*)，1O2

*在水溶液中不稳定，会迅速转变为普通氧分子，将多余的能量以红光放出，从而产生发光现象［22－23］。NaIO4氧化甲氧氯普胺时几乎检测不出发光强度，而当在NaIO4－H2O2体系中加入少量甲氧氯普胺后化学发光强度明显增大，所以甲氧氯普胺在高碘酸钠－过氧化氢－磷酸化学发光体系中是作为能量的接受体，从而增强化学发光，其机制属于分子间的能量转移［24］。基于上述各观点，推测本文所应用的体系发光机理如下:

3 结论

本文研究了在酸性条件下，溴化钠对NaIO4－H2O2－甲氧氯普胺的化学发光反应，利用流动注射技术建立了一种测定甲氧氯普胺的新方法。结果表明，该方法准确、灵敏度高，对片剂中甲氧氯普胺含量的检测与尿液中的加标回收实验结果表明该方法有望进一步应用于临床分析。

［1］Zhou K W，Gu X M，Cui X C，Chen X C.Acta Chim.Sin.(周考文，顾雪梅，崔晓超，陈晓翠.化学学报)，2011，69(2):221－225.

［2］Jia B X，Tang B.Chin.J.Anal.Lab.(贾宝秀，唐波.分析试验室)，2004，18(3):112－116.

［3］Wang A J，Fan J，Feng S L，Cui F L.Spectrosc.Spectral Anal.(王爱军，樊静，冯素玲，崔凤灵.光谱学与光谱分析)，2005，25(3):432－435.

［4］Liu J C，Li H K，Yu L L.Chin.J.Spectrosc.(刘佳川，李华侃，于丽丽.光谱实验室)，2009，26(5):1340－1343.

［5］Badawy S S，Shoukry A F，Issa Y M.Analyst，1986，111(12):1363.

［6］Rao H L，Aroor A R，Rao P G.Indian Drugs，1991，28(4):195 －196.

［7］Li X X，Zhao W Q，Miao L X，Liu Q R.J.Instrum.Anal.(李晓霞，赵文琴，苗力孝，刘启瑞.分析测试学报)，2010，30(11):1126－1131.

［8］Shi J，Wang X H，Wen J W，Wu J K，Zhang Q.Chin.J.Pharm.Anal.(石杰，王兴辉，闻京伟，吴家锴，张倩.药物分析杂志)，2010，30(1):117－119.

［9］Hun X，Zhang Z J.Pharm.Biomed.Anal.，2008，47(5):670 －676.

［10］Zhao Y F，Zhang N，Wei Q，Han Y Y，Mao K X，Cai Y Y，Li R.Spectrosc.Spectral Anal.(赵燕芳，张诺，魏琴，韩颜颜，毛珂霞，蔡燕燕，李茹.光谱学与光谱分析)，2010，30(9):2512－2517.

［11］Xue B C，Wang T，Liu E B.Spectrosc.Spectral Anal.(薛冰纯，王滔，刘二保.光谱学与光谱分析)，2006，26(5):816－819.

［12］Wu Z H，Li G M，Wang J Z，Liu K Z，Liu X H，Fan S L.Chem.Res.(吴志皓，李桂敏，王金中，刘快之，刘绣华，范顺利.化学研究)，2005，16(3):87－89.

［13］Fan S L，Zhang L，Wu Z H，Lin J M.Chin.J.Anal.Lab.(范顺利，张磊，吴志皓，林金明.分析试验室)，2003，22(2):48－50.

［14］Liu W，Sun L，Zhang Z J.J.Shaanxi Normal Univ.:Nat.Sci.Ed.(刘伟，孙丽，章竹君.陕西师范大学学报:自然科学版)，2006，34(3):59－61.

［15］Al－Arfaj N A.Talanta，2004，62(2):255－263.

［16］Shi W B，Yang J D，Jiang H.Chin.J.Anal.Lab.(石文兵，杨季冬，江虹.分析试验室)，2008，27(4):48－51.

［17］Ye L，Zhang G F，Chen H Y.Chem.J.Chin.Univ.(叶蕾，张国芳，陈洪渊.高等学校化学学报)，2000，21(1):59－61.

［18］Nie F，Ning G H，Wu Y C，He Y H，Deng B.Chin.J.Anal.Lab.(聂峰，宁光辉，吴迎春，何云华，邓斌.分析试验室)，2006，25(11):58－62.

［19］Nie F，Zhai B Q，Wu Y C.J.Mod.Lab.Med.(聂峰，翟宝清，吴迎春.现代检验医学杂志)，2008，23(6):40－43.

［20］Xu W M，Gan N，Pan J G，Yu Y F，Jia X H.Guangdong Trace Elements Science(徐伟民，干宁，潘建国，余杨锋，郏宣华.广东微量元素科学)，2006，13(4):48－52.

［21］Editorial Committee of the Pharmacopeia of the People s Republic of China.The Pharmacopoeia of People s Republic of China(PartⅡ).Beijing:Chemical Industry Press(中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典.2部.北京:化学工业出版社)，2005:120.

［22］Khan A V，Kasha M.Nature，1964，204:241－243.

［23］Khan A V，Kasha M J.J.Am.Chem.Soc.，1966，88(7):1574－1577.

［24］Li L J，Zhong Z H，Chen Q F，Feng J，Kong H X，Wu J L.Phys.Test.Chem.Anal.:Chem.Anal.(李利军，钟招亨，陈其锋，冯军，孔红星，吴健玲.理化检验:化学分册)，2008，44(9):868－870.