胰腺癌细胞中GDNF对MMP-9表达的影响*

郭仁德王伟忠 顾建华王 毅 谷 川

胰腺癌发生胰周神经浸润的比例高达53.5%～100%[1]，神经浸润被认为是导致肿瘤局部复发、转移和预后不良的极为重要的因素，但其确切分子机制至今尚不明确。近年来的一些研究表明，由胰腺内外的神经组织产生的许多神经营养因子、黏附分子参与了胰腺癌的神经侵袭过程，其中胶质细胞源神经营养因子（GDNF）在此过程中的作用日益受到重视[2]。基质金属蛋白酶（MMP）是一个蛋白水解酶家族，可促进细胞外基质（ECM）中蛋白成分的降解，在肿瘤细胞侵犯中起非常重要的作用[3]。近年来有研究显示MMP-9在胰腺癌中过度表达，并且与蛋白水解反应、淋巴侵犯及GDNF的表达相关[4]。本研究采用不同检测方法，旨在探讨胰腺癌细胞中GDNF对MMP-9表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2（M.D.Andson癌症中心馈赠），Capan-2（中南医学院附属医院馈赠），GDNF蛋白（天津市津脉基因测绘技术有限公司），鼠抗人RET单克隆抗体 （北京中杉生物技术有限公司），MMP-9多克隆抗体、TaqDNA聚合酶（美国Santa Cruz公司），MMP-9 ELISA试剂盒 （北京中杉生物技术有限公司），试剂盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0，Bradford蛋白浓度测定试剂盒 （天津灏洋）。普通PCR仪:GeneAmp PCR Systerm 9700， 梯度 PCR 仪：Mastercycler gradient，KODAK 凝胶成像系统:Kodak digital science image station 440，酶标仪（TECAN A-5082）。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR检测胰腺癌细胞中GDNF对MMP-9 mRNA表达的影响 胰腺癌MIA PaCa-2和Capan-2细胞培养，对照组用DMEM培养基，实验组加入100μg/L GDNF培养24 h。胰腺癌RNA提取，进行浓度测定和质量判定，RT-PCR法检测胰腺癌细胞中MMP-9的表达。MMP-9引物应用Oligo 6.0软件自行设计。引物由上海生工生物技术有限公司合成。序列上游：5′-TCTGGAGGTTCGACGTGAAG-3′；下游：5′-GGGCACTGCAGGATGTCATA-3′， 引物长度 220 bp。PCR反应体积为25μL，含 cDNA模板 2μL以及 1.5μmol/L MgCl2、50μmol/L dNTPs、上下游引物各0.1 μmol/L 和TaqDNA聚合酶1 U。反应条件如下：94℃预变性3 min，94℃变性45 s、53℃退火45 s、72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸10 min，4℃终止反应。反应完成后，取5μL扩增产物常规进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。每次扩增均设DMEM阴性对照组，每组5孔，各重复5次。

1.2.2 Western blot法检测GDNF对MMP-9蛋白表达的影响 胰腺癌细胞培养，对照组用DMEM培养基，实验组加入100μg/L GDNF培养24 h,每组5孔。消化离心收集细胞后，PBS清洗3遍，将细胞置于1.5 mL EP管中，加入1 mL（含1%PMSF）的RIPA裂解液，摇匀置于冰上裂解30 min，裂解后于4℃下12 000 r/min离心5 min，取上清液并测定蛋白浓度，取40μg蛋白与上样缓冲液混合，煮沸5 min，置于十二烷基硫酸钠（SDS）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、电转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用 1%牛血清白蛋白（BSA）封闭，用稀释度1∶1 000的兔抗人MMP-9多克隆抗体4℃过夜，加入相应的二抗室温下孵育60 min，按试剂盒说明书进行抗体检测。

1.2.3 ELISA法检测GDNF对MMP-9蛋白表达的影响 根据标准品光密度（OD）450值画出标准曲线，MIA PaCa-2和Capan-2胰腺癌细胞培养，待培养液中细胞贴壁生长且基本铺满瓶底，细胞状态良好时，胰酶消化、细胞计数，将细胞制成2×104/mL悬液。将细胞悬液加入96孔板，每孔加入200 μL培养液。每种细胞分别设置7组：GDNF最终质量浓度分别为0、10、20 、50、80、100 和 120 μg/L，每组 5 孔。37 ℃，5%CO2分别培养24、48和72 h。移液器分别取100μL培养基酶标仪检测OD450值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件包，两均数间比较采用两独立样本t检验，多个均数间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 GDNF对MMP-9 mRNA表达的影响 MIA PaCa-2和Capan-2两种胰腺癌细胞系中，实验组MMP-9表达条带较对照组明显增粗、变亮，见图1、2。

2.2 Western blot法检测GDNF对MMP-9蛋白表达的影响 MIA PaCa-2和Capan-2两种胰腺癌细胞系中，对照组有很弱的MMP-9蛋白的表达，而实验组MMP-9蛋白表达明显增强，见图3。MIA PaCa-2和Capan-2细胞系中对照组MMP-9蛋白表达分别为1.3±0.2和1.1±0.4，实验组分别为1.9±0.3和1.8±0.7，2组比较差异有统计学意义 （t分别为3.171 和 3.219，均 P<0.01）。

Figure 1 The influence of GDNF on the expression of MMP-9 mRNA in MIA PaCa-2 human pancreatic carcinoma cell line图1 MIA PaCa-2胰腺癌细胞系中GDNF对MMP-9 mRNA表达的影响

Figure 2 The influence of GDNF on the expression of MMP-9 mRNA in Capan-2 human pancreatic carcinoma cell line图2 Capan-2胰腺癌细胞系中，GDNF对MMP-9 mRNA表达的影响

Figure 3 The expression of MMP-9 protein图3 MMP－9蛋白的表达

2.3 ELISA法检测GDNF对MMP-9蛋白表达的影响 MIA PaCa-2和Capan-2胰腺癌细胞系中，均可见代表MMP-9蛋白表达水平的OD450值随加入GDNF值的增高而增高，于GDNF浓度为100μg/L，48 h 时达最大值，见图4、5，表1、2。

3 讨论

胰腺癌在生物学行为上具有高度侵袭性，肿瘤很小时即可有神经、血管或周围淋巴的侵犯，甚至远处转移，已属于晚期胰腺癌，即使获得手术切除，术后也很快复发和转移，预后仍然很差。近年来，随着影像医学的发展，一些早期胰腺癌可被发现，但侵袭与转移仍是治疗失败和因瘤死亡的主要原因。肿瘤侵袭和转移的过程主要依赖于侵袭性肿瘤细胞蛋白溶解活性的增强 。MMPs、组织蛋白酶B和D以及纤溶酶原激活物是参与转移级联过程（metastaticcascade）的化学物质[5]。

Figure 4 The influence of GDNF on the expression of MMP-9 protein in MIA PaCa-2 human pancreatic carcinoma cell line图4 MIA PaCa-2胰腺癌细胞系中GDNF对MMP－9蛋白表达的影响

Figure 5 The influence of GDNF on the expression of MMP-9 protein in Capan-2 human pancreatic carcinoma cell line图5 Capan－2胰腺癌细胞系中GDNF对MMP－9蛋白表达的影响

Table 1 Statistics of influence of GDNF on the expression of MMP-9 protein in MIA PaCa-2 human pancreatic carcinoma cell line表1 MIA PaCa-2胰腺癌细胞系中GDNF对MMP－9蛋白表达影响的统计量

Table 2 Statistics of influence of GDNF on the expression of MMP-9 protein in Capan-2 human pancreatic carcinoma cell line表2 Capan-2胰腺癌细胞系中GDNF对MMP－9蛋白表达影响的统计量

MMPs是一组锌离子依赖性的内肽酶，属于蛋白水解酶的一种，它的作用底物较多，有纤维胶原蛋白、弹性蛋白、层黏连蛋白、明胶及蛋白多糖等，几乎能降解细胞外基质的所有成分。近年来的实验研究发现MMP在恶性肿瘤的侵袭及转移中发挥着重要作用。目前，MMPs家族由11个成员组成。根据其结构和底物特异性将其划分成4组：胶原酶、白明胶酶、基质降解酶及其他。MMP-9又称为明胶酶B，是MMPs中分子量最大的酶。以酶原形式分泌，被激活后形成Ⅳ型胶原酶，降解、破坏靠近肿瘤表面的Ⅳ型、V型胶原和明胶，然后肿瘤细胞沿着缺失的基底膜向周围浸润，最终导致肿瘤的侵袭和转移。另一方面则通过毛细血管内生、新生血管生成等促进肿瘤浸润和转移[6]。因此，MMP-9在癌细胞浸润、转移中起重要作用。

Okada等[7-8]对GDNF是否能调节人胰腺癌细胞MMP-9的表达和活性进行了研究，结果显示GDNF提高MIA PaCa－2细胞株中MMP-9 mRNA和蛋白质表达是有剂量依赖性的。GDNF增强了前体和活性形式MMP-9溶解明胶的能力。抑制物试验显示前体MMP-9的表达和活性能被genistein完全抑制，被Wortmannin部分抑制，而PD98059没有影响。三者都能抑制MMP-9的活性，说明在MIA PaCa-2中，GDNF通过不同的信号传导通路上调MMP-9的表达和酶活性，GDNF可能通过调控MMP-9的表达和活性促进了胰腺癌的侵犯。本研究利用RT-PCR法检测GDNF对MMP-9 mRNA表达的影响，结果显示加入100μg/L GDNF后，MMP-9 mRNA的表达明显增强，提示胰腺癌细胞中GDNF能上调MMP-9 mRNA的表达。

本研究应用Western blot法检测检测GDNF对MMP-9蛋白表达的影响，对照组有很弱的MMP-9蛋白的表达，而加入100μg/L GDNF组MMP-9蛋白表达明显增强，采用双夹心ELISA法检测GDNF对MMP-9蛋白表达的影响，显示代表MMP-9蛋白表达水平的OD450值随加入GDNF值的增高而增高，于GDNF浓度为100μg/L，作用48 h达最大值，提示GDNF可上调MMP-9蛋白的表达。但是由于MMP-9蛋白表达量较低，未能从标准曲线中读取具体数值，还需一种更为精细的方法来测量。

综上所述，GDNF具有上调胰腺癌细胞MMP-9表达的作用,可促进MMP-9 mRNA及蛋白的表达，从而增强胰腺癌细胞的侵袭能力。

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