基于蓖麻毒素B链的新型黏膜免疫佐剂设计及靶向效果初步评价①

郭建巍 秦力维 冯健男 付凯飞 王珍光 赵强元

(海军总医院检验科，北京100048)

研究和开发能诱导机体产生早期、高效和持久免疫应答的、黏膜免疫佐剂是感染免疫和疫苗领域的热点和重点［1-5］。蓖麻毒素(ricin)B链(RTB)含有两个半乳糖结合部位，几乎能与所有真核细胞上含半乳糖基的糖蛋白或糖酯结合。由于RTB与巨噬细胞和网状内皮细胞结合的这一独特性质，有学者在疫苗研制中使用RTB将抗原直接靶向抗原呈递细胞，并取得了良好的免疫效果［6-10］。

本课题组在前期研究中获得一株与RTB特异性结合的中和性单抗3E1，可在体内外完全阻断各种细胞与RTB结合［11］。本研究拟通过生物信息学技术，确定RTB与细胞特异性结合的活性肽部位，构建含不同肽的绿色荧光蛋白原核表达载体，实现肽-绿色荧光蛋白融合蛋白在大肠杆菌中的高效、可溶性表达。通过小鼠舌下口服肽-GFP融合蛋白后［12］，初步评价GFP在不同RTB有效组分靶向下在体内的分布，为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 相关软件 计算机理论模拟所用硬件为美国IBM图形工作站(Intellistation Z Pro);软件为Dock 5.4(Kuntz I.D，UCSF);SYBYL7.3 软件包;InsightⅡ2005程序包(分子对接Dock程序、动力学模拟Discover-3程序);筛选用数据库为基于Specs小分子数据库(2008)转换的三维结构数据库(GOLDMAN);其他软件有CVFF力场、Gromos 96力场;同源模建Homology;分子设计Ludi;静电分布分析Delphi。

1.2 主要试剂 大肠杆菌 JM109、BL21、pET30a(+)载体由本室保存;质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒(Promega);限制性内切酶 Bgl II和 EcoR I(NEB)、Taq 酶、Pryobest酶、dNTPs、T4 DNA 连接酶(Takara);镍离子亲和层析柱(Invitrogen);PCR引物合成及DNA测序(华大蛋白);Anti-Mouse CD11c PE、Anti-Mouse CD11c(eBioscience);Super Polymer-二步法 IHC试剂盒、鼠 Streptavidin-HRP试剂盒、DAB显色试剂盒(×20)、柠檬酸抗原修复液(×100)、改良型苏木素等试剂均为(CWbio.Co.Ltd)

1.2 方法

1.2.1 小分子肽-GFP融合蛋白的表达 根据四个小分子肽和GFP目的基因序列，将小肽和连接臂进行密码子优化，进行PCR引物设计。设计的引物如下:P1F:CATGCCATGGCAAGCAGTGAGAAGGCTGAACAACAGTGGGCTGGTTCTGGCAGCATG;P1M:CAGTGGGCTGGTTCTGGCAGCATGGTGAGCAAGCA GATCCTGAAGAAC;P2F:CATGCCATGGCAATTCGTCCTCAGCAGAACCGTGACAATGGTTCTGGCAGCATG;P2M:CGCGATAATGGTTCTGGCAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG;P3F:CATGCCATGGCAACTAACAACACACAACCTTTCGTGACAACCGGTTCTGG CAGCATG;P3M:GTGACAACCGGTTCTGGCAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG;P4F:CATGCCATGGCACACAATGGCAACGCAATCCAGTTGTGGCCAGGTTCTGGCAGCATG;P4M:TTGTGGCCAGGTTCTGGCAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG;GFP钓取引物;P5F:F:CATGCCATGGCAGGTTCTGGCAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG;R:GATATCTTATCTAGATCCGGTGGATCCCG;通过2次PCR将不同的肽与GFP连接到一起，将获得的5个目的基因，用常规分子克隆技术构建原核表达载体pET30a(+)，酶切位点为Bgl II和EcoR I(NEB)，用镍金属离子螯合柱进行纯化并鉴定。

1.2.2 免疫效果评估 分别以0、14、28免疫程序给BALB/c小鼠舌下口服纯化的四种融合蛋白和GFP 50 μg，每组6只，共6组30只鼠，雌雄各半。分别于初次和再次免疫后的次日免疫组化和流式细胞术检测GFP和CD11c在不同组织中的表达。所取组织分别用0.01 mol/L pH7.2 PBS洗涤2次，去除脂肪，研磨后用200目尼龙网过滤，取悬液1 500 r/min 5分钟洗涤2次，取1×106细胞待用。实验时每管分别加 100 μl 0.01 mol/L pH7.2 PBS，根据抗体说明书加入抗体室温孵育30分钟，1 000 r/min离心5分钟，弃上清，加500 μl PBS重悬后上机;免疫组化按常规技术进行。

2 结果

2.1 RTB与细胞特异性结合部位的确定

2.1.1 利用分子模拟技术搭建本课题组获得的自主知识产权抗体3E1的轻、重链抗体空间构象。

具有自主知识产权抗体3E1重链氨基酸序列如下:SGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWIKQRPGHGLEWIGDILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCSRSFYYNYDGAYFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC。

选择同源性高的模板蛋白(PDB库号:2V7H)，进行序列比对，结果见图1。

经分子模拟、力学优化获得的抗体重链(VH+CH1)构象(图2)。

2.1.2 具有自主知识产权抗体3E1轻链的氨基酸序列如下:QMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDIKKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。类似地，对3E1轻链进行序列比对，结果见图3。

图1 高同源性模板蛋白(PDB库号:2V7H)，序列比对结果Fig.1 Sequence comparison result with High Homologous templet protein(PDB:2V7H)

图2 经分子模拟、力学优化获得的抗体重链(VH+CH1)构象Fig.2 Heavy chain conformation after molecular mimicry and mechanical optimization

图3 对3E1轻链进行序列比对结果Fig.3 The result of sequence comparison of light chain 3E1

经分子模拟、力学优化获得抗体轻链(VL+CL)构象(图4)。

图4 经分子模拟、力学优化获得的抗体轻链(VL+CL)构象Fig.4 Light chain conformation after molecular mimicry and mechanical optimization

2.2 利用RTB结构，通过抗原-抗体复合物之间的作用确定3E1与RTB复合物空间构象。

2.2.1 利用分子对接及蛋白模板对3E1的Fab结构进行模拟，并利用分子力学、动力学优化获得其稳定构象(图5)。

2.2.2 利用RicinB结构，通过抗原-抗体作用复合物确定3E1与Ricin B复合物空间构象(图6)。

2.3 利用距离几何学、分子间氢键以及 van der Waals相互作用，合理判定3E1识别RTB的活性区域，并推导出核苷酸序列。

利用距离几何学、分子间氢键以及 van der Waals相互作用，合理判定3E1识别Ricin B的活性区域:SSEKAEQQWA;IRPQQNRDN;TNNTQPFVTT;HNGNAIQLWP。优势依次为 SSEKAEQQWA＞TNNTQPFVTT＞IRPQQNRDN＞HNGNAIQLWP。将筛选出的4个RTB与单抗特异性结合活性的部位，经www.ncbi.nlm.nih.gov blast-P 序列比对，推导出 4个核苷酸序列。agc agt gaa aag gct gaa caa cag tgg gct;ata cgt cct cag caa aac cgc gat aat;act aat aat aca caa cct ttt gtg aca acc;cac aat gga aac gca ata cag ttg tgg cca。

2.4 初次免疫后GFP和CD11c在不同组织中的分布 四种小分子肽与GFP融合蛋白(P1-GFP～P4-GFP)分别免疫小鼠，初次免疫后次日，流式细胞术和免疫组化分别检测GFP和CD11c在不同组织中的分布。结果显示GFP初次免疫后GFP主要分布于胃中(图7、9)，P1-GFP初次免疫后GFP主要分布于空肠，结果与 GFP免疫组和其他3组(P2-GFP～P4-GFP)有明显不同(图8、9)。GFP在肠相关淋巴组织、肠系膜淋巴结和小肠PP结的分布实验组(P1-GFP～P4-GFP)和GFP对照组并无明显差别。

图5 抗体的Fab构象飘带结构Fig.5 ribbon-like structure of Fab

图6 蓖麻毒素B链与抗体的作用模式Fig.6 Pattern action of ricin toxin B with antibody

图7 初次免疫后小鼠胃中GFP表达情况Fig.7 Expression of GFP in stomach after primary immunity

图8 初次免疫后小鼠空肠中GFP表达情况Fig.8 Expression of GFP in jejunum after primary immunity

图9 初次免疫后GFP在胃和空肠中的分布情况Fig.9 Expression of GFP in stomach and jejunum after primary immunity

图10 初次免疫后CD11c在肠系膜淋巴结、胃和空肠中的分布情况Fig.10 Expression of CD11c in adenomesenteritis，stomach and jejunum after primary immunity

图11 再次免疫后GFP在不同组织中的表达Fig.11 Expression of GFP in different tissures after secondary immunity

图12 再次免疫后CD11c在不同组织中的表达Fig.12 Expression of CD11c in different tissures after secondary immunity

初次免疫后P1-GFP免疫组CD11c+细胞主要分布于在肠系膜淋巴结中，与GFP免疫组和其他3组(P2-GFP～P4-GFP)有明显的不同，此外，P1-GFP免疫组CD11c+细胞在空肠中也有较高的表达(图10)。

2.5 再次免疫后GFP和CD11c在不同组织中的分布 再次免疫后次日，分别取小鼠胃、肠相关淋巴组织、脾脏、肠系膜淋巴结、小肠PP结、回肠、空肠等组织，分别用免疫组化和流式细胞术分析。结果显示再次免疫后，小鼠脾脏、胃和空肠中，GFP免疫组与GFP肽融合蛋白组(P1-GFP～P4-GFP)GFP表达无明显差别。再次免疫后，P1-GFP免疫组GFP在肠相关淋巴组织(D)、回肠(F)和小肠(G)的表达明显高于GFP免疫组和其他肽GFP融合蛋白组(P2-GFP～P4-GFP);肠系膜淋巴结中GFP免疫组GFP的表达与肽GFP融合蛋白组(P1-GFP～P2-GFP)也有明显的差异(图11)。

再次免疫后，P1-GFP免疫组 CD11c在空肠(H)的表达明显高于GFP免疫组和其他肽GFP融合蛋白组(P2-GFP～P4-GFP)(图12)，P1-GFP免疫组CD11c在脾脏和肠系膜淋巴结也有一定表达。肠相关淋巴组织、小肠PP结、胃、回肠等组织，GFP组与GFP肽融合蛋白组(P1-GFP～P4-GFP)CD11c表达无明显差别。

3 讨论

机体约有95%以上的感染发生在黏膜或由黏膜侵入机体，由此引起的黏膜损伤及黏膜免疫功能的紊乱，常成为自身免疫性疾病或机会感染发生的重要诱因，因此，防治黏膜感染在人类健康中占有举足轻重的地位［13］。

虽然机体黏膜免疫的机制还不完全清楚。但由于目前使用抗原的免疫原性普遍较弱，使基于黏膜免疫疫苗诱导的免疫应答持续时间短，免疫保护效果不佳。研究和开发能诱导机体产生早期、高效和持久免疫应答的、黏膜免疫佐剂已成为感染免疫和疫苗领域的热点和重点。

蓖麻毒素(ricin)是由A、B两条多肽链通过二硫键连接成的异二聚体。A链(RTA)为效应链，具糖苷酶活性，有使核糖体失活的能力。B链(RTB)为结合链，含有两个半乳糖结合部位，几乎能与所有真核细胞上含半乳糖基的糖蛋白或糖酯结合。A链只有在B链的帮助下，才能定位于细胞表面，并穿过细胞膜破坏其核蛋白体60s亚单位，抑制蛋白质的合成，从而导致细胞死亡。

由于RTB与巨噬细胞和网状内皮细胞结合的这一独特性质，有学者在黏膜免疫疫苗的研制中使用RTB将抗原直接靶向抗原呈递细胞，并取得了良好的免疫效果。虽然RTB不同组分融合蛋白激发的免疫应答类型不尽相同，其作用机理也不清楚，但所有结果均提示RTB及有效组分可以作为激发全身和黏膜免疫反应的有效佐剂。由于RTB与细胞的结合可引起非特异性毒性［14］，因此如何减低其毒性并保留活性成分，阐明RTB及有效组分在免疫应答中的作用机理，对研制基于RTB及有效组分的黏膜免疫疫苗尤为重要。

本研究中我们利用本实验室获得的具有自主知识产权的RTB中和性单抗3E1的空间构象，应用距离几何学、分子间氢键以及van der Waals相互作用，合理判定3E1识别RTB的四个活性区域，并推导出对应的核苷酸序列和氨基酸序列，试图通过小分子肽的导向作用，将目的蛋白靶向单核巨噬细胞特别是树突状细胞，以激发有效的免疫应答。通过构建含不同肽的绿色荧光蛋白原核表达载体，实现了四个小分子肽GFP融合蛋白在大肠杆菌中的高效、可溶性表达。

动物实验结果显示，四个小分子肽GFP融合蛋白(P1-GFP～P4-GFP)免疫小鼠后，P1-GFP免疫组GFP和CD11c在不同组织中的分布与GFP免疫组和其他3个肽GFP融合蛋白(P2-GFP～P4-GFP)免疫组有明显的区别。P1-GFP融合蛋白初次免疫小鼠后经P1肽的导向，GFP主要分布于空肠，而未经导向的GFP免疫组，初次免疫后GFP主要分布于胃。提示P1-GFP融合蛋白中融合的小分子肽在黏膜免疫中发挥了导向作用，使抗原直接进入小肠进而引发初次免疫应答。再次免疫后，小鼠体内GFP分布与初次免疫后也有明显不同，GFP分布范围更广，GFP在P1肽的导引下主要集中于回肠、肠相关淋巴组织和小肠PP结。研究结果进一步证明了小分子肽的导向作用，使GFP直接进入小肠PP结和肠系膜淋巴结两个黏膜免疫应答的主要诱导及效应部位。由于小肠PP结在淋巴组织中解剖部位上具有独特性，即有传出淋巴管，无传入淋巴管，小分子肽可将GFP等抗原直接带到免疫应答的诱导部位，利于免疫应答的发生。P1-GFP融合蛋白初次免疫小鼠后小鼠体内的树突状细胞即CD11c+细胞主要分布于肠系膜淋巴结，在空肠中也有较高表达。再次免疫后小鼠体内的树突状细胞分布发生了改变，肠系膜淋巴结中的CD11c+细胞不再占优势，而是空肠中CD11c+细胞明显增加。提示再次免疫后肠道的树突状细胞分布发生了改变，主要集中于易于抗原接触的部位，利于免疫应答的发生。至于P1-GFP融合蛋白免疫效果如何有待进一步实验证实。

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