益生菌 L.Casei Zhang对大鼠急性肝损伤的保护作用及其对 TLR4-ERK-PPAR-γ通路的影响①

谢基明 王玉珍 张 威 云小乐 巩 培 刘竟然 赵世敏 康鸿斌 张和平

(内蒙古自治区人民医院检验科，呼和浩特010010)

益生菌是指那些活的、在摄入一定数量后对宿主有益的微生物［1］。有研究表明，一些益生菌在预防和治疗肠道病原菌感染方面积极有效［2，3］。特别地，植物乳酸菌K68可以显著抑制脂多糖(LPS)诱导的肿瘤坏死因子 α(TNF-α)和前列腺素 E2(PGE2)的表达，从而保护葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎［4］。因为肝肠轴的存在，通过服用益生菌来预防肝脏疾病得到越来越多的关注。已经有研究报道显示，益生菌对于因饮酒、病毒感染以及代谢性疾病引起的慢性肝损伤有保护作用［5，6］。最近的研究表明，口服乳酸菌、双歧杆菌和蓝莓可以减轻LPS和D-氨基半乳糖(D-GalN)诱导的急性肝损伤。另外一项研究表明，植物乳酸菌与L-精氨酸联合使用可以保护内毒素诱导的肝损伤［7］。然而其中机制尚不明确。

Lactobacillus Casei Zhang(L.Casei Zhang)是从马奶酒中分离到的一株新的乳酸菌。该菌表现出良好益生菌的特性，如耐酸、耐胆汁、能够在胃肠道定植［8］。我们以前的体内实验表明，L.Casei Zhang能够促进小鼠分泌 IgA和 IFN-γ［9］。在本实验中，本实验中以LPS/D-GalN腹腔注射建立大鼠肝损伤模型，研究L.Casei Zhang对急性肝损伤的保护作用研究。进一步地，我们探索了L.Casei Zhang发挥保肝作用的分子机制。本研究为开发益生菌 L.Casei Zhang的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂 LPS(O55:B5)和 D-GalN购自Sigma公司。TLR4、p-ERK抗体购自Cell Signaling公司。PPAR-γ和actin抗体购自 Santa Cruz公司。TNF-α酶联免疫(ELISA)试剂盒购自R＆D公司。反转录试剂盒和Taq酶，购自大连宝生物公司。NO测定试剂盒为南京建成生物公司产品。

1.2 实验动物 健康雄性Wistar大鼠，体重120～140 g，购自北京维通利华实验动物公司。22℃恒温房内饲养，标准颗粒混合饲料(由内蒙古大学动物中心提供)喂养，自由饮水。购买动物适应1周后开始实验。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组与给药 48只Wistar大鼠随机分为4组:对照组(CTRL)，模型组(L/G)，益生菌组(L/G+LCZ)，地塞米松组(L/G+DXM)。通过腹腔注射 LPS(50 μg/ml)与D-GalN(300 mg/kg)建立急性肝损伤模型。益生菌组在建模前30天每日每只大鼠灌服1×109CFU益生菌L.Casei Zhang。地塞米松组在造模前腹腔注射地塞米松(10 mg/kg)。

1.3.2 标本采集 造模后16小时处死大鼠，切开腹部，下腔静脉取血，切取肝脏右叶4%多聚甲醛固定。其余肝脏液氮冻存。

1.3.3 组织病理学分析 多聚甲醛固定肝脏组织48小时后，进行石蜡包埋、切片、HE染色。采用盲法由病理医生观察组织病理学变化。

1.3.4 免疫组织化学染色 石蜡切片(5 μm)经常规脱蜡水化后，用免疫组织化学SP法测定实验动物肝脏组织中TLR4和p-ERK的表达水平。TLR4工作浓度为1∶50，p-ERK工作浓度为 1∶100。SP试剂盒购自福建迈新生物技术公司。具体操作方法参照SP免疫组织化学试剂盒。

1.3.5 PPAR-γ 表达的检测 采用TRIZOL法提取肝脏组织的总RNA。RNA完整性通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测OD260和OD280的吸光度，计算RNA的浓度。1 μg RNA反转录cDNA。以sence 5'-GGAAGCCCTTTGGTGACTTTATGG-3'和antisence 5'-GCAGCAGGTTGTCTTGGATGTC-3'为 PPAR-γ 引物;以 sence 5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3'和 antisence 5'-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3'为GAPDH引物做PCR。肝脏组织中PPAR-γ蛋白的表达采用Western blot方法，具体方法参见文献［10］。

1.3.6 其他检测指标 (1)ALT和AST。血液离心后收集血清，采用全自动生化分析仪检测血清中ALT和AST水平。(2)TNF-α。肝脏组织匀浆后，采用ELISA试剂盒检测匀浆上清中TNF-α的表达水平。(3)NO。采用NO测定试剂盒检测肝脏匀浆上清中NO的表达水平。

1.4 统计学分析 应用 SPSS17.0软件进行ANOVA分析，P＜0.05时认为具有显著性差异。

2 结果

2.1 L.Casei Zhang对急性肝损伤大鼠血清ALT和AST以及肝脏中TNF-α和NO表达的影响 从表1可以看出，与对照组相比，腹腔注射LPS与D-GalN后血清ALT和AST水平显著增高(P＜0.01)，说明急性肝损伤造模成功。与模型组相比，益生菌组和地塞米松组的ALT和AST水平显著降低。检测肝脏组织中炎性因子TNF-α和NO也发现，益生菌组与地塞米松组肝脏中TNF-α和NO表达水平与模型组相比也显著降低(P＜0.01)。

2.2 L.Casei Zhang减轻急性肝损伤大鼠肝脏病变由图1可以看出，对照组(CTL)大鼠肝脏组织正常，肝小叶结构可辨，肝索排列整齐;模型组(L/G)的大鼠肝脏肝索排列紊乱，出现肝细胞坏死灶。益生菌治疗组(L/G+LCZ)仅出现部分肝细胞坏死，而且肝脏出现巨噬细胞增生性结节，表明益生菌有促进肝脏修复的功能。地塞米松组(L/G+DXM)大鼠的肝脏细胞质均匀，个别区域有细胞坏死灶。

表1 L.Casei Zhang对急性肝损伤大鼠ALT、AST、TNF-α和NO表达的影响Tab.1 Effects of L.Casei Zhang on the expression of ALT，AST，TNF-α and NO

图1 肝脏切片HE染色的病理学改变(×400)Fig.1 Histological alteration of hematoxylin-eosin-stained liver sections(×400)

2.3 L.Casei Zhang对急性肝损伤大鼠肝脏TLR4表达的影响 为了进一步探索益生菌 L.Casei Zhang保护急性肝损伤大鼠的机制，我们检测了实验各组大鼠肝脏组织中TLR4的表达水平。从图2可以看出，模型组(L/G)TLR4的表达水平显著高于对照组(CTRL)。益生菌和地塞米松处理后，TLR4的表达水平显著下降，表明益生菌以及地塞米松保护大鼠急性肝损伤与下调TLR4的表达有关。

2.4 L.Casei Zhang对急性肝损伤大鼠肝脏p-ERK表达的影响 鉴于TLR4信号通路活化后会活化下游的MAPK通路，我们随后检测了MAPK通路中的ERK的磷酸化水平。从图3可以看出，与TLR4的表达增高相一致，模型组(L/G)的p-ERK表达水平明显增高。与模型组相比，益生菌组(L/G+LCZ)和地塞米松(L/G+DXM)的p-ERK表达显著降低，表明益生菌和地塞米松发挥保肝作用与降低ERK的磷酸化水平有关。

图2 L.Casei Zhang降低急性肝损伤大鼠肝脏TLR4的表达(×400)Fig.2 L.Casei Zhang reduced the hepatic TLR4 expression in rats with acute liver injury(×400)

图3 L.Casei Zhang降低急性肝损伤大鼠肝脏平p-ERK的表达(×200)Fig.3 L.Casei Zhang reduced the hepatic p-ERK expression in rats with acute liver injury(×200)

2.5 L.Casei Zhang对急性肝损伤大鼠肝脏PPAR-γ表达的影响 我们检测了肝脏组织中PPAR-γ的表达水平。与TLR4和p-ERK的表达增高相反，LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤大鼠肝脏的PPAR-γ的mRNA与蛋白水平都显著降低。在益生菌与地塞米松处理后，PPAR-γ的mRNA和蛋白表达有所恢复，表明益生菌与地塞米松通过上调PPAR-γ的表达发挥抗炎作用。

图4 L.Casei Zhang上调急性肝损伤大鼠肝脏平PPAR-γ的表达Fig.4 L.Casei Zhang up-regulates PPAR-γ expression in rats with acute liver injury

3 讨论

LPS联合D-GalN诱导的急性肝损伤模型是一种非常理想的动物模型，因为该模型与由内毒素血症以及败血症诱发的肝炎的临床表现非常相似。在该动物模型中，由于血液中LPS的存在，导致机体的天然免疫应答系统被过度活化，从而产生过量的前炎症因子，加速了肝损伤进程。在LPS诱发的前炎性因子中，TNF-α与肝细胞的坏死以及肝衰竭的发生密切相关［11］。此外，LPS/D-GalN诱导产生的活性氧也是急性肝衰竭病因之一［12］。因此有效控制TNF-α以及活性氧的产生是预防以及治疗急性肝损伤的有效措施。我们的研究表明，L.Casei Zhang能保护LPS/D-GalN诱导的肝损伤，表现为降低血清中ALT和AST水平，以及降低肝脏TNF-α和NO的表达。在组织病理学水平我们也证实，L.Casei Zhang显著改善了肝脏的病理损伤。在本实验中，地塞米松作为阳性对照药物来治疗急性肝损伤。尽管L.Casei Zhang的保护作用不及地塞米松，但是，本实验中采用的大剂量的地塞米松(10 mg/kg)会引起严重的副作用。因此，益生菌L.Casei Zhang具有潜在的保肝作用，有待于进一步开发。

在我们的实验中，我们着重探讨了益生菌L.Casei Zhang发挥保肝作用的机制。我们检测了肝脏组织中TLR4以及TLR4信号通路的变化。以前的研究表明，TLR4信号通路在肝损伤病理过程中发挥重要作用［13］。此外，在LPS/D-GalN诱导的肝损伤过程中TLR4的表达水平增高［14］。我们的研究结果与该结果一致。然而，在益生菌组以及地塞米松组TLR4的表达水平显著下调。与此结果一致的是，TLR4下游信号通路中的ERK通路中，ERK的磷酸化水平也显著降低，表明益生菌L.Casei Zhang是通过调节TLR4信号通路来发挥保肝作用的。

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是一类能被过氧化物酶体增殖物激活的核内受体。亚家族之一的PPAR-γ可以在多个水平调控细胞内多条炎症信号转导途径。其中，PPAR-γ对转录因子NF-κB的抑制作用是其发挥抗炎效应的分子基础［15］。我们的研究表明，在LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤过程中，PPAR-γ的表达下调。然而益生菌和地塞米松作用后，PPAR-γ和表达水平有所上调。益生菌L.Casei Zhang能够促进PPAR-γ的表达是本文的新发现，对于阐明其作用机理提供了新的线索。

总之，我们的结果显示，益生菌 L.Casei Zhang对LPS/D-GalN诱导的肝损伤作用有保护作用。这种保护作用与下调TLR4以及TLR4信号通路、与上调PPAR-γ的表达有关。该实验结果表明，益生菌L.Casei Zhang对于肝脏感染性疾病有潜在的预防作用。

1 Reid G.Food and Agricultural Organization of the United Nation and the WHO.The importance of guidelines in the development and application of probiotics［J］.Curr Pharm Des，2005;11:11-16.

2 Cunningham-Rundles S，Ahrné S，Johann-Liang R et al.Effect of probiotic bacteria on microbial host defense，growth，and immune function in human immunodeficiency virus type-1 infection［J］.Nutrients，2011;3(12):1042-1070.

3 de LeBlanc Ade M，Castillo N A et al.Anti-infective mechanisms induced by a probiotic Lactobacillus strain against Salmonella enterica serovar Typhimurium infection［J］.Int J Food Microbiol，2010;138(3):223-231.

4 Liu Y W，Su Y W，Ong W K et al.Oral administration of Lactobacillus plantarum K68 ameliorates DSS-induced ulcerative colitis in BALB/c mice via the anti-inflammatory and immunomodulatory activities［J］.Int Immunopharmacol，2011;11(12):2159-2166.

5 Cesaro C，Tiso A，Del Prete A et al.Gut microbiota and probiotics in chronic liver diseases［J］.Dig Liver Dis，2011;43(6):431-438.

6 Wang Y，Kirpich I，Liu Y et al.Lactobacillus rhamnosus GG treatment potentiates intestinal hypoxia-inducible factor，promotes intestinal integrity and ameliorates alcohol-induced liver injury ［J］.Am J Pathol，2011;179(6):2866-2875.

7 Rishi P，Bharrhan S，Singh G et al.Effect of Lactobacillus plantarum and L-arginine against endotoxin-induced liver injury in a rat model［J］.Life Sci，2011;89(23-24):847-853.

8 张和平，孟和毕力格，王俊国et al.分离自内蒙古传统发酵酸马奶中L.casei Zhang潜在益生特性的研究［J］.中国乳品工业，2006;34(6):4-10.

9 Ya T，Zhang Q J，Chu F L et al.Immunological evaluation of Lactobacillus casei Zhang:a newly isolated strain from koumiss in Inner Mongolia，China［J］.BMC Immunol，2008;9:68-76.

10 Wang Y，Chen T，Han C et al.Lysosome-associated small Rab GTPase Rab7b negatively regulates TLR4 signaling in macrophages by promoting lysosomal degradation of TLR4［J］.Blood，2007;110(3):962-971.

11 Jambekar A A，Palma E，Nicolosi L et al.A glutamine synthetase inhibitor increases survival and decreases cytokine response in a mouse model of acute liver failure ［J］.Liver Int，2011;31(8):1209-1221.

12 LekiC N，Cerny D，Horínek A et al.Differential oxidative stress responses to D-galactosamine-lipopolysaccharide hepatotoxicity based on real time PCR analysis of selected oxidant/antioxidant and apoptotic gene expressions in rat［J］.Physiol Res，2011;60(3):549-558.

13 Ben-Ari Z，Avlas O，Fallach R et al.Ischemia and reperfusion liver injury is reduced in the absence of toll-like receptor 4［J］.Cell Physiol Biochem，2012;30(2):489-498.

14 Kitazawa T，Tsujimoto T，Kawaratani H et al.Expression of toll-like receptor 4 in various organs in rats with D-galactosamine-induced acute hepatic failure［J］.J Gastroenterol Hepatol，2008;23(8 Pt 2):e494-498.

15 Magee T R，Han G，Cherian B et al.Down-regulation of transcription factor peroxisome proliferator-activated receptor in programmed hepatic lipid dysregulation and inflammation in intrauterine growthrestricted offspring［J］.Am J Obstet Gynecol，2008;199(3):271.e1-5.