鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的原核表达及保守性分析①

张小姣 曹 炬 黄世峰 张莉萍

(重庆医科大学附属第一医院检验科，重庆400016)

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，AB)为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致病菌。该菌是唯一能在人类皮肤表面生存的革兰阴性杆菌，对湿热、紫外线、化学消毒剂和外界环境有较强抵抗力。它是院内感染的重要病原菌之一，其耐药率也呈逐年上升趋势［1-3］，甚至出现了对碳青霉烯酶和多粘菌素耐药的菌株［4-6］。由于抗菌药物的局限性越来越明显，因此，必须积极开发新的药物来防治多重耐药鲍曼不动杆菌的感染。疫苗可能是一个未来的研究方向。

国外有研究报道其全菌疫苗，但安全性差，亟待开发更为安全的蛋白疫苗。外膜蛋白A(Out membrane protein A，OmpA)是一个分子量大小为38 kD，氨基酸保守性大于99%的蛋白质，是目前功能研究最确定的毒力因子［7］;同时，它也是含有丰富抗原位点的外膜蛋白，能引起上皮细胞免疫应答信号通路表达上调。由此，该蛋白可能是一个良好的候选蛋白疫苗［8］。本研究构建 OmpA的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，转化大肠杆菌 BL21(DE3)诱导表达目的蛋白质，经镍柱亲和层析获得纯化蛋白。并分析该基因在各临床菌株中的保守性以及讨论了该蛋白作为鲍曼不动杆菌单位疫苗的前瞻性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鲍曼不动杆菌标准菌株(ATCC 19606)购自美国菌种保藏中心;DH5α、pET28a(+)和BL21(DE3)感受态细胞为实验室保存。

1.1.2 试剂盒 Premix购自大连宝生物公司;细菌DNA提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega公司;限制性内切酶 BanHⅠ、HindⅢ 以及 T4连接酶购自NEB;辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠(人)IgG抗体购自中杉生物公司;引物合成由上海英骏公司合成;Ni-NTA蛋白纯化试剂盒购自Novagen;弗氏佐剂购自Sigma公司;其余生化试剂均购自国内试剂公司。

1.1.3 实验动物 BALB/c小鼠，SPF级，雌性，6～8周龄，体重18～22克购于重庆医科大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 pET28a(+)原核表达载体的构建ATCC19606细菌培养16～18小时，提取DNA，扩增OmpA蛋白编码基因。上游引物:5'-ACAGGATCCATGAAATTGAGTCGTATT-3'，下游引物 5'-ACAAGCTTTTATTGAGCTGCTGCA-3'。反应条件为:94℃预变性5分钟，94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 1分钟，循环次数30次，72℃延伸10分钟。利用PCR纯化试剂盒将产物和提取的质粒纯化，根据引物设计的限制性内切酶BanHⅠ和HindⅢ，对纯化的PCR产物和质粒进行双酶切反应。酶切产物在T4连接酶的作用下进行体外连接，与感受态E.coil(DH5α)作用后，转入感受态细菌。用LB平板(含卡那霉素)初步筛选获得该质粒的菌株，挑选单个菌落进行酶切鉴定并送测序。提取构建成功的质粒，同样通过转化感受态大肠杆菌BL21，获得含目的基因的表达菌株。经比对，重组质粒pET28a(+)/OmpA测序结果与GeneBank报道序列完全一致。

1.2.2 OmpA蛋白的原核表达条件优化 取BL21重组表达菌株，同时以含有空载体的菌株作对照，分别挑取单菌落至3 ml液体LB培养基(含50 μg/ml卡那霉素)，37℃培养过夜。取2 ml菌液于10 ml新鲜LB培养基中(含50 μg/ml卡那霉素)，37℃、200 r/min 培养至 OD600=0.6 ～0.7，加入 IPTG 至终浓度分别为 0.5、0.8、1.0、1.3、1.5 mmol/L。诱导5小时后吸取1 ml菌液，离心，沉淀悬浮于200 μl ddH2O中，以1∶4的比例加入5×SDS样品缓冲液，100℃煮沸5分钟后，上样，SDS-PAGE电泳观察重组蛋白的诱导表达水平。同样按照上述方法，在最佳诱导浓度的条件下，收集诱导时间为3、4、5、6小时的菌液，SDS-PAGE电泳观察重组蛋白诱导表达水平。诱导剂量和时间固定后，在25℃和37℃的温度下诱导，观察不同温度的诱导水平。最后，根据以上表达条件优化，确定重组蛋白为上清或包涵体表达。

1.2.3 重组蛋白的纯化 重组菌大量诱导表达OmpA蛋白，收集后菌体以3 g/ml悬浮在结合缓冲液中，超声破碎20～30分钟，12 000 r/min，10分钟离心取上清。将纯化柱用结合缓冲液平衡后，在样本中加入10 mmol/L的咪唑后上样，可以降低非特异性蛋白与镍柱结合。用含50 mmol/L咪唑的漂洗缓冲液洗柱去除杂蛋白，最后用10 ml洗脱缓冲液洗脱并收集目的蛋白。蛋白洗脱液通过超滤管(按照Minipore说明书)减少咪唑和盐离子浓度，上样前测蛋白质浓度和SDS-PAGE观察纯化效果。

1.2.4 OmpA基因保守性的检测 以临床分离的20株菌株为模板，上诉引物为扩增条件，扩增该菌种的OmpA基因。

1.2.5 抗血清的收集和 Western blot 领取6～8周左右的 BALB/c雌性小鼠10只，分别在1、7、21天免疫小鼠。纯化蛋白与弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂按比例混合并乳化，最后得到蛋白浓度为50 μg/μl。每次注射蛋白佐剂乳化物200 μl(含10 μg OmpA)。免疫后1周，取小鼠心脏血，10 000 r/min，离心取小鼠血清。保存于－20℃备用。临床不同基因型别(PFGE不同分型)的五株临床菌株为样本，小鼠血清作为一抗，羊抗鼠IgG作为二抗，ECL显色的方法检测小鼠血清对临床菌株的抗原抗体保护作用。

1.2.6 重组蛋白免疫小鼠后的生存率观察

1.2.6.1 小鼠攻毒细菌剂量确定 为了增加细菌毒力，我们用临床分离的一株鲍曼不动杆菌A腹腔攻毒小鼠，两小时后观察到小鼠发病，如弓背，竖毛时，剪开小鼠胸腔，进行无菌心脏取血。血液在LB固体培养基上培养18小时，LB培养基上长出纯菌落，经梅里埃vitek-compact鉴定仪鉴定，此菌为鲍曼不动杆菌。将该菌在LB液体培养基中增菌16～18小时，PBS洗涤3次后调整菌液浓度分别为1.25×108、2.5×108、5×108CFU/ml。9 只小鼠分成 3 组，每组3只，按照以上3个菌液浓度，每只200 μl腹腔注射。观察发现最高浓度剂量组小鼠两天内死亡，其余小鼠14天内存活，确定该实验中此菌致小鼠死剂量为1×108CFU。

1.2.6.2 小鼠生存率计算 领取6～8周左右的BALB/c雌性小鼠20只。10只免疫蛋白剂量和步骤同前，剩余10只以弗氏佐剂和PBS免疫小鼠做对照。第三次免疫小鼠1周后，以腹腔注射方式给予鲍曼不动杆菌菌株A:1×108CFU，观察小鼠21天生存率。各组小鼠生存率用Fisher进行统计学计算。

1.2.7 病人血清中OmpA抗体检测 OmpA蛋白浓度稀释为5 μg/L，每孔100 μl，4℃过夜包被在空白ELISA 96孔板，甩干包被液体，1%BSA封闭1小时。人血清为样本，稀释浓度分别为1∶100、1∶200、1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶10 000、1 ∶20 000。每孔加 100 μl稀释血清，37℃孵育2小时。HRP酶标二抗37℃孵育1小时。显色剂显色15～20分钟，酶标仪读取A450吸收值。

2 结果

2.1 OmpA基因蛋白编码区的扩增 提取ATCC19606 DNA，按照上述反应条件扩增OmpA的基因(1 071 kb)，结果表明扩增片段大小与预期值相符(如图1示)。

2.2 OmpA/pET28a(+)原核表达载体的酶切鉴定构建质粒酶切后跑琼脂糖凝胶电泳，如图2示，酶切后目的基因和质粒被切开，显示重组载体构建成功。阳性克隆株送英骏公司测序结果与OmpA基因序列一致，编码基因大小为1 071 kb。

图1 OmpA PCR扩增产物Fig.1 PCR products for OmpA

2.3 重组蛋白的表达和纯化 通过改变诱导时间、诱导温度和诱导剂浓度来确定OmpA的最佳表达条件。通过实验发现该蛋白的最佳表达条件为:25℃，诱导剂浓度为1.3 mmol/L，诱导5小时，此时上清表达量最高。裂菌液上清经过Ni-NTA纯化，纯化后的蛋白经过SDS-PAGE和凝胶成像分析软件分析，纯度可达90%以上，Bardford法测得超滤后蛋白浓度为0.4 mg/ml(图3)。

2.4 基因保守性检测 我们随机选取了20株临床分离的鲍曼不动杆菌扩增OmpA基因，结果显示(如图4)所选取的菌株都能扩增出基因，提示该基因的保守性较好。

2.5 Western blot分析鲍曼不动杆菌OmpA蛋白保守性 纯化重组蛋白免疫了小鼠后获得了多克隆抗体血清。我们选取了临床分离的五个不同基因型别的临床菌株(PFGE分型)和 ATCC19606，发现OmpA在各菌株中都有表达(如图5)，提示该蛋白保守性较高，且抗体血清能够识别和结合临床分离鲍曼不动杆菌。

2.6 小鼠生存率观察 小鼠生存率结果如图6所示。蛋白免疫组小鼠生存率显著高于对照组 (P＜0.05)。结果提示，重组蛋白 OmpA免疫 BALB/c小鼠可以对抗A.baumanni的腹腔感染。

2.7 正常人血清OmpA抗体检测 我们检测了7例鲍曼不动杆菌定植病人和6例体检人员的血清抗OmpA抗体，两者抗体水平无明显差异(如图7)，显示人群中含有OmpA抗体，它不会与自身抗原发生交叉反应。

图2 重组表达载体的双酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant of pET28a(+)/OmpA

图3 重组蛋白纯化SDS-PAGE电泳图Fig.3 SDS-PAGE analysis for recombinant OmpA protein

图4 20株临床菌株OmpA扩增产物Fig.4 PCR products for OmpA gene of 20 clinical strains

图5 Western blot分析OmpA在各菌株中的表达Fig.5 Western blot analysis for OmpA expression in some A.baumanni

3 讨论

图6 主动保护实验小鼠生存率结果(P＜0.05)Fig.6 Vaccination with rOmpA protected mice from lethal A.baumannii intraperitoneal infection(P＜0.05)

图7 人血清OmpA抗体滴度Fig.7 The antibody titers of OmpA in human serum

由于抗生素治疗的有限性，因此，必须积极开发新的药物来防治多重耐药鲍曼不动杆菌的感染。接种疫苗就是一种最有潜力和期待的方式。有文献报道用减毒的死菌体和外膜蛋白复合物作为免疫原研究该疫苗的有效性［9，10］。虽然它们有丰富的抗原位点和较强的保护效能，但是应该考虑前者的安全性和后者制作成本太高等不足。A.baumannii OmpA是一个优质的具有前瞻性的疫苗候选蛋白，已有文献报道其作为抗原免疫小鼠后，小鼠脾细胞因子水平上升证明该免疫蛋白的免疫原性［11］。

作为一个良好的亚单位蛋白抗原，必须具备高度的保守性并与人体自身抗原的氨基酸序列几乎无同源性［12］。在本实验中验证了OmpA蛋白在基因水平和蛋白表达水平的高度一致性。经酶切鉴定和基因测序结果显示，鲍曼不动杆菌OmpA基因片段被正确克隆到 pET-28a(+)原核表达载体中。OmpA基因片段的核苷酸序列长度为1 071 bp，与GeneBank中序列相一致，无碱基突变。重组工程菌经IPTG诱导，在BL21(DE3)菌中表达出了分子量约为38 kD的rOmpA融合蛋白。重组蛋白主要以可溶形式表达在上清液，经 Ni-NTA树脂纯化后得到了纯度＞90%的重组蛋白。有文献报道该蛋白在氨基酸序列上具有99%的一致性［11］。该报道收集了6株不同型别的菌株，菌株收集时间跨越了1951～2009年间隔五十几年的时间，而且分离自不同的临床样本，包括脑脊液、肺部、血液、伤口分泌物。发现该蛋白质的氨基酸序列的相似性＞99%。通过比对Pubmed一些不同序列的鲍曼不动杆菌菌株发现89%的全菌基因序列相一致。相反，本研究过程中通过BLAST比对，ATCC19606 OmpA序列与人的基因序列几乎不具有同源性。由此证明，OmpA基因保守性高度一致，而与人的同源性非常小，是一个良好的的亚单位蛋白候选疫苗。

同时，A.baumannii OmpA是一个重要的膜孔蛋白，在细菌感染的病理过程中发挥着重要的作用。它能激活抗原提呈细胞——树突细胞，后者使CD4+T细胞分化成为 Th1细胞，激活并放大免疫反应［13］。此外，有文献报道鲍曼不动杆菌通过外膜小泡分泌和传递致病因子给宿主细胞，并评估了外膜小泡中OmpA的毒性活性，结果显示有OmpA的外膜小泡导致宿主细胞凋亡，而OmpA突变体未能导致细胞凋亡。由此说明，如果通过抗体阻断OmpA对上皮细胞的粘附与损伤，就能大大降低细菌对机体的侵袭力［14］。在我们的小鼠生存率实验中，免疫小鼠的生存时间明显长于对照组小鼠，生存率也高于对照组，说明免疫小鼠在一定程度上能够抵抗鲍曼不动杆菌的侵袭。因此，OmpA是一个良好的候选疫苗蛋白。

本实验研究了A.baumannii OmpA基因的保守性，在分离的20株临床菌株中都有该基因的表达。在蛋白水平上，免疫后的小鼠血清均能识别临床菌株，结果显示免疫小鼠能产生该蛋白特异性的多克隆抗体，并能与临床菌株发生抗原抗体反应。基因水平和蛋白表达水平均具有良好的保守性，是作为一个良好的亚单位蛋白疫苗的前提。此外，正常人群中也检测到该蛋白的抗体滴度，可能是正常人上呼吸道定植了鲍曼不动杆菌，当机体免疫力低下的时候可引起致病，也有可能是人体本身携带的其他正常细菌体产生的免疫反应作用，结果说明人群中含有OmpA抗体，它不会与自身抗原发生交叉反应。综上所述，OmpA具有作为亚单位疫苗的优点，是鲍曼不动杆菌良好的疫苗靶点。亚单位疫苗由于抗原位点的局限性，在以后的研究中希望能找到更多的亚单位蛋白分子制成联合疫苗，大大提高疫苗的保护效果。

1 汪 复，朱德妹，胡付品 et al.2008年中国CHINET细菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2009;9(5):321-329.

2 张小江，徐英春，俞云松 et al.2009年中国CHINET鲍曼不动杆菌细菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2010;10(6):441-446.

3 朱德妹，汪 复，胡付品 et al.2010年中国CHINET细菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2011;11(5):321-329.

4 Perez F，Hujer A M，Hujer K M et al.Global challenge of multidrugresistant Acinetobacter baumannii［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007;51(10):3471-3484.

5 Higgins P G，Dammhayn C，Hackel M et al.Global spread of carbapenemresistant Acinetobacter baumannii［J］.J Antimicrob Chemother，2010;65(2):233-238.

6 Doi Y，Husain S，Potoski B A et al.Extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii［J］.Emerg Infect Dis，2009;15(6):980-982.

7 McConnell M J，Actis L，Pacho'J.Acinetobacter baumannii:human infections，factors contributing to pathogenesis and animal models［J］.FEMS Microbiol Rev，2012;3:1-26.

8 Soon Ae Kim，Sung Min Yoo，Sung Hee Hyun et al.Global gene expression patterns and induction of innate immune response in human laryngeal epithelial cells in response to Acinetobacter baumannii outer membrane proteinA［J］.Fems Immunol Med Mic，2008;54(1):45-52.

9 McConnell M J，Pachón J.Active and passive immunization against Acinetobacter baumannii using an inactivated whole cell vaccine［J］.Vaccine，2011;29:1-5.

10 McConnell M J，Domínguez-Herrera J，Smani Y et al.Vaccination with outer membrane complexes elicits rapid protective immunity to multidrug-resistant acinetobacter baumannii［J］.Infect Immunity，2011;1:518-526.

11 Lin Lina，Brandon Tan，Paul Pantapalangkoor et al.Acinetobacter baumannii rOmpA vaccine dose alters immune polarization and immunodominant epitopes［J］.Vaccine，2013;31:313-318.

12 Manuel J Rodríguez-Ortega，Nathalie Norais，Giuliano Bensi et al.Characterization and identification of vaccine candidateproteins through analysis of the group A Streptococcus surface proteome［J］.Nature Biotechnology，2006;24(2):191-197.

13 Lee J S，Lee J C，Lee C M et al.Outer membrane protein A of Acinetobacter baumannii induces differentiation of CD4+T cells toward a Th1 polarizing phenotype through the activation of dendritic cells［J］.Biochemical Pharmacology，2007;74:86-97.

14 Jong Sook Jin， Sang-Oh Kwon， Dong Chan Moon et al.Acinetobacter baumannii secretes cytotoxic outer membrane protein A via outer membrane vesicles［J］.PLoS ONE，2011;6(2):e17027.