PPARα转基因小鼠在药物评价中的应用研究

尉明晓，秦 超，陈 威，高 洁，赵显莉，高 虹

(中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

代谢综合症(表现为高血压、内脏肥胖、胰岛素抵抗、脂质代谢异常)的治疗是目前医学界面临的一大难题。过氧化物酶体增殖激活受体 α(peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα)，参与调控脂质代谢和免疫反应等生理过程，能够改善代谢综合征的状况。因此，近年来，临床上的PPARα激动剂药物常被用来进行降血脂的治疗。使用PPARα转基因小鼠进行PPARα激动剂药物的临床前评价，建立一种药效学敏感的动物模型，用于该类药物的早期筛选，为药物研发机构节约时间和经费，为人类的临床用药提供理论依据。本课题着重探讨利用 PPARα转基因小鼠进行PPARα激动剂药物的药效学评价的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验动物

PPARα转基因小鼠，由中国医学科学院医学实验动物研究所遗传中心构建，6月龄的C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号 SCXK(京)2012-0001。36只小鼠饲养于SPF级环境中，动物设施许可证号 SYXK(京)2008-0012。饲喂的高脂饲料购自军事医学科学院实验动物中心，饲料配方为:猪油10%，蔗糖15%，胆固醇1%，蛋黄粉10%，胆酸钠0.1%，基础鼠料63.9%，饲料合格证:SCXK(军)-2007-005。

1.2 试剂以及仪器

非诺贝特药物由北京益民药业有限公司生产。7100型全自动生化分析仪，日本日立公司产品。

1.3 动物分组以及给药方法

实验小鼠总共分为4组。27只PPARα转基因小鼠随机分成3组，每组9只，分别为对照组1、高剂量组(非诺贝特60 mg/kg)、低剂量组(非诺贝特30 mg/kg)。人每天用药物非诺贝特剂量为0.3 g，按照“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”，20 g小鼠和70 kg人的交叉汇合处为0.0026，按人的平均体重70 kg计算，小鼠的折合剂量为0.3 g/70 kg×70 kg×0.0026/20 g=39 mg/kg。选取 60 mg/kg作为高剂量，30 mg/kg作为低剂量组，同时设置9只C57BL/6小鼠作为对照组2。每只动物灌胃体积为0.2 mL/10 g体重。各种小鼠在同等的SPF级环境下饲养，自由摄食、饮水。各组动物分别在6周龄时给予高脂饲料喂养一个月，然后连续非诺贝特灌胃一个月。分别于给药前后检测动物的肝功能指标、肾功能指标和血脂生化指标(表1)。

表1 实验小鼠分组及给药方法Tab．1 The medication method and group of laboratory mouse

1.4 观察指标与方法

1.4.1 大体观察

每天观察一次，观察指标包括小鼠外观和行为(包括小鼠的皮肤毛发，眼和黏膜的变化，呼吸，中枢神经系统，四肢活动及其他表现)、分泌物和排泄物等。每周测定小鼠体重。

1.4.2 血生化指标的检测

4组实验小鼠在非诺贝特灌胃前、灌胃结束后眼眶静脉丛取血，留取血清检测血液生化指标。肝脏功能的指标包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬门氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)。肾脏功能的指标包括血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCR)。血脂生化的指标包括胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(NEFA)。

1.5 统计学分析

采用SPSS 12.0统计软件进行分析，结果以表示，P＜0.05为差异具有显著性，P＜0.01为差异非常具有显著性，P＜0.001为差异极其具有显著性。统计学方法为t检验，方差分析，非参数检验。

2 结果

2.1 一般体征观察

整个实验过程中小鼠的皮肤正常无脱毛现象，眼睛与黏膜无异常分泌物，呼吸平稳，活动正常，无抽搐震颤等异常现象发生。动物给药后体重变化不大，各组之间的体重没有明显差异(P＞0.05)(表2)。

2.2 PPARα激动剂对血生化指标的影响

动物开始给药前，各组之间的10项血生化指标没有显著性差异(P＞0.05)(表3)。①给药后各组比较:从图1可以看出，与对照组1比较，非诺贝特各剂量组均能明显升高CHO(P＜0.05)和HDL-C(P＜0.01)，明显降低 TG(P＜0.05)。各组之间的体重没有明显差异(P＞0.05)。与对照组2比较，非诺贝特各剂量组均能显著升高 HDL-C(P＜0.01)，显著降低 TG(P＜0.01)，提示 PPARα转基因小鼠对该药物更敏感。②给药前后各组比较:从图1可以看出，与给药前比较，给药后高剂量组能明显降低 ALT、AST、ALP、BUN、TG(P ＜ 0.05);能明显升高CHO、HDL-C(P＜0.01)。而低剂量组能明显降低ALP(P＜0.05);能明显升高 CHO、HDL-C(P＜0.05)，但肾功能指标在正常范围内，没有临床意义。结果提示高剂量组的降血脂效果优于低剂量组。给药前后的血生化指标(表3)。

表2 给药后小鼠体重变化Tab．2 Change of mouse weight with the medication administration

表3 给药前后的血生化指标变化Tab．3 Change of serum index with the medication administration

图1 给药前后血生化的变化。Fig．1 Change of serum index(ALT、AST、ALP、CHO、TG、HDL-C)with the medication administration．

3 讨论

PPARα受体是今年来新发现的一种甾体激素类受体，作为PPARα受体的一个亚型，在脂质代谢、炎症过程、免疫反应等生理过程中发挥着巨大的作用。PPARα主要分布在代谢活性较高的组织中，如肾、肝、心脏、肌肉组织［1］。PPARα 在肝脏脂质代谢中发挥着巨大的作用。PPARα激动剂围绕降血脂这一中心功能与临床上许多疾病有关，比如改善脂质代谢、动脉粥样硬化、心血管疾病、非酒精性脂肪肝、抗炎、保护血管内皮等作用［2－10］。

代谢综合症表现为高血压、内脏肥胖、胰岛素抵抗、脂质代谢异常，它的治疗是医学界面临的一大难题。PPARα基因参与调控脂质代谢和免疫反应等生理过程，能够改善代谢综合症的症状［11］。

转基因动物具有与人类相似的疾病致病原因、机制的优点，使用其评价的药物，其结果更加准确。转基因动物已在抗肿瘤药物、抗艾滋病药物、抗肝炎病毒药物、肾脏疾病药物的筛选中取得了突破性的进展［12］。本课题着重利用PPARα转基因小鼠进行PPARα激动剂药物的药效学评价。

有文献报道［13－14］，PPARα 激动剂降低甘油三酯的水平，升高高密度脂蛋白胆固醇成分，能够诱导胆固醇从巨噬细胞和泡沫细胞里移出。在导致低血糖的长时间的禁食下，脂肪酸从脂肪沉积的部位游走到肝脏，在肝脏它们被摄取，氧化和代谢成酮体，PPARα在这代谢过程中能起到中枢性的作用［15］。本文的实验结果与文献报道一致，脂肪酸的下降不明显可能与灌胃时间为一个月有关，延长灌胃时间可能会出现脂肪酸的下降。关于脂肪酸的下降方面的研究值得我们进一步探讨。

与给药前比较，给药后高剂量组和低剂量组能明显升高 CHO、HDL-C，能明显降低肝功能指标。临床上高血脂常伴有轻到重度的脂肪肝，引起肝功能指标的上升，PPARα激动剂能够显著改善脂肪肝的状况［10］，在本实验中给药后高剂量组能明显降低ALT、AST、ALP，与文献报道结果一致。在 PPARα 转基因小鼠体内，非诺贝特给药一个月能改善肝脏功能及降血脂作用。

根据本试验结果提示，PPARα转基因小鼠与C57BL/6相比，在评价PPARα激动剂药效学方面比常规C57BL/6小鼠更敏感，是一个新的、敏感的动物模型。

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