引起犬脓皮病皮肤表层细菌分离鉴定

2013-11-26管庆松袁雪波项勋代飞燕肖啸云南农业大学动物科学技术学院云南昆明650201云南省红河州动物疫病预防控制中心云南蒙自

山东畜牧兽医 2013年1期

管庆松袁雪波项勋代飞燕* 肖啸（云南农业大学动物科学技术学院云南昆明 650201 云南省红河州动物疫病预防控制中心云南蒙自）

引起犬脓皮病皮肤表层细菌分离鉴定

管庆松①袁雪波②项勋①代飞燕①*肖啸①（①云南农业大学动物科学技术学院云南昆明 650201 ②云南省红河州动物疫病预防控制中心云南蒙自）

本试验通过采集患犬表层脓液进行细菌分离和纯化培养，之后在麦康凯、伊红美蓝、8.5%NaCl高盐培养基和血琼脂培养基上做鉴别培养；结果23个样本中有葡萄球菌9株、链球菌8株、大肠杆菌5株、其它杂菌1株；对分离得到的细菌做药敏试验，结果表明，金黄色葡萄球菌、链球菌对头孢孟多、庆大霉素、氟哌酸敏感，大肠杆菌对恩诺沙星、头孢孟多、庆大霉素敏感。

犬脓皮病细菌分离鉴定药敏试验

犬脓皮病是危害犬较为严重的皮肤病之一。近年来，随着人们的生活水平的迅速提高，宠物行业也不断发展，犬脓皮病越来越多。所以对犬脓皮病病原菌的的研究也显得格外的重要［1］。抗生素仍是目前治疗犬脓皮病的常用药物，以抗生素为主的治疗引起耐药性问题，可能引起犬脓皮病难治愈及复发率高[2]。为了更好地控制犬脓皮病，试验通过对患犬细菌分离鉴定及药敏结果，筛选出主要的病原菌类型和最合理的抗生素药物，为指导临床科学用药、有效降低犬脓皮病的发病率、更好地控制和治疗犬脓皮病，促进宠物业的健康持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料采集病料采自云南农大动物医院的患脓皮病犬，共采集病变部位脓液23份装入灭菌瓶中并编号，置于4℃冰箱。

1.1.2 试验试剂中性红、结晶紫、95%乙醇、碘液、麦康凯培养基、SS琼脂培养基、伊红美蓝培养基、NaCl、琼脂粉等。

1.1.3 试验仪器 4℃冰箱(5R1410)，日本三阳；多段可编程光照培养箱(PGX型)，宁波东南仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-g240A)，上海中支仪器设备有限公司；超净工作台(AIRTECH)，苏静集团安泰公司。

1.2 试验方法

1.2.1 分离培养和纯化先用划线培养法将脓液在普通琼脂培养基涂平，不能涂得太过密集，以免细菌长的太密集难以分到单个菌落。24h后在每个培养基上挑取几个单个菌落于普通肉汤培养基上进行增菌培养。

1.2.2 染色、镜检试验采用革兰氏染色法，首先将细菌在干燥的载玻片上涂匀并固定好，滴加草酸铵结晶紫作用2min后水洗，然后滴加革兰氏碘液媒染2min后水洗，再以95%酒精脱色1min水洗，继而滴加石碳酸复红复染30s后水洗，最后等涂片干燥后拿于显微镜下观察，经初步镜检，发现疑似有链球菌、葡萄球菌和大肠杆菌。将初步镜检后疑似大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌的菌落用相应的培养基进行鉴别培养[3]。

1.2.3 鉴别培养（1）链球菌的鉴别培养：在超净工作台上将样品分别接种到血琼脂培养基上，并且标明接种的编号。接种时用采样的棉签轻轻涂抹于培养基的一头，之后用接种环以“Z”字型画开，每涂过培养皿的一半时旋转90°，接种环烧白灭菌后继续沿“Z”字画开。接种完成后将培养皿放入37℃恒温培养箱培养24h。出现明显的β溶血现象且呈灰白色初步判断为化脓性链球菌，而无溶血现象呈黄色菌落初步判断为金黄色葡萄球菌[4]。（2）葡萄球菌的鉴别培养：高盐琼脂培养基就是在普通培养基基础上加8.5%Nacl。用划线法将细菌均匀的涂布于平板上，在此培养基上能够生长的是葡萄球菌。（3）大肠杆菌的鉴别培养：采用划线法将细菌分别涂于麦康凯琼脂培养和伊红美蓝培养基上，麦康凯琼脂培养基上呈粉红色菌落为阳性，伊红美蓝琼脂培养基上呈铁锈色菌落为阳性，不生长为阴性［5］。

1.2.4 生化鉴定使用凝固酶、麦芽糖、甘露醇、V-P试验、透明质酸、耐热核酸酶、马尿酸钠、七叶苷、山梨醇、乳糖、葡萄糖、棉实糖、海藻糖、水杨苷、菊糖、棉子糖、蕈糖、山梨醇、8.5% NaC1、蔗糖等分别配制生化鉴定管。将培养皿中的典型菌种在超净工作台上接种至鉴定管中，置于37℃24h后观察结果［6］。

1.2.5 药敏试验选用头孢孟多、庆大霉素、链霉素、四环素、红霉素、氟哌酸、林可霉素、妥布霉素、恩诺沙星、菌必治等几种常用药物的药敏试纸采用纸片扩散法[7]对分离菌株做药敏试验，测抑菌圈直径(包括药敏纸片直径)，根据抑菌圈判断实验结果。

2 结果与分析

2.1 细菌的鉴别培养

将采集的样本在普通琼脂培养基上培养之后，挑取单个菌落接种到普通肉汤培养基，采用革兰氏染色法初步判断初球菌和杆菌，再通过鉴别培养基进行鉴定，能在麦康凯琼脂培养和伊红美蓝培养基上生长，麦康凯琼脂培养基上呈粉红色菌落为阳性，伊红美蓝琼脂培养基上呈铁锈色菌落为阳性，不生长为阴性。结果分离到5株大肠杆菌。通过血琼脂培养基和高盐琼脂培养基初步鉴定出9株疑似金黄色葡萄球菌，8株疑似化脓性链球菌，对疑似球菌的菌株做生化鉴定。

2.2 疑似葡萄球菌的生化鉴定

表1 疑似葡萄球菌生化鉴定结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

表1结果表明，对能在高盐培养基上生长的球菌做生化鉴定，有9株菌株符合金黄色葡萄球菌的生化特性。

2.3 疑似链球菌的生化鉴定

表2 疑似链球菌生化鉴定结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

表2结果表明，对于不能于高盐培养基上生长的球菌做生化鉴定，有8株菌株符合化脓性链球菌的生化特性。

2.4 所有病原菌的数量比例和分类

表3 犬脓皮病病原菌检出结果

2.5 药敏试验结果

表4 三种细菌药敏试验结果 (mm)

由表3和表4可知，金黄色葡萄球菌和链球菌对头孢孟多、庆大霉素、氟哌酸敏感，对庆大霉素、氯霉素、红霉素已出现耐药趋势，对四环素、链霉素几乎无效；大肠杆菌对恩诺沙星、头孢孟多、庆大霉素敏感，对链霉素、菌必治、妥布霉素已出现耐药趋势，而对林可霉素几乎无效。

3 讨论

通过对犬脓皮病表层病原菌的分离鉴定。分离到3种主要致病菌，分别为葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌，说明葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌是目前造成犬脓皮病的主要致病菌种［8］。葡萄球菌、链球菌是条件性致病菌［9］，这与张绪洪等[8]报道的一致。葡萄球菌广泛存在于周围环境及人和动物的皮肤及粘膜，当有利繁殖的因素出现时，即会侵害犬的皮肤造成化脓感染，这就需要平时做好预防工作。当犬的皮肤发生病变时要考虑到继发脓皮病的可能性，避免感染扩散造成严重的后果。