“水包水”法制备壳聚糖-多聚磷酸钠微囊

肖新才，官亚兰，王振环，杜欢欢

(中南民族大学药学院，武汉430074)

壳聚糖(chitosan)是天然生物大分子甲壳素N－脱乙酞基的衍生物，它不仅具备良好的生物活性［1，2］、生物相容性、体内可降解性以及成膜性能［3］，还具有消炎、抗菌、止血和抑制癌细胞转移等特殊功能，因而以CS为原料制备微囊成为靶向给药的新热点，并广泛应用于药物控释［4］、酶的固定化［5］、细胞的包埋［6］等领域.但目前关于壳聚糖的微球或微囊的的方法多以醛类(如戊二醛、甲醛)为交联固化剂，这种交联剂有毒，且该法对制备蛋白质和肽类药物应用受限［7］.

壳聚糖与多聚磷酸钠(TPP)是两种分别带正电荷与负电荷，无毒、生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料，因良好的成膜性被广泛用于药物载体等领域［8］.离子凝胶法是利用多聚磷酸钠对壳聚糖进行离子诱导凝胶化而制备纳米粒，通过壳聚糖醋酸溶液和多聚磷酸钠水溶液的浓度差和两水相混合物的离子凝结作用形成微囊.

水包水乳液是将水溶性聚合物在分散剂的作用下分散到水溶性介质中制得的聚合物乳液［9］，它以水为介质，在分散剂和稳定剂的作用下合成的聚合物以微粒状稳定存在水溶液中，较油包水乳液固含量大、黏度低，可直接稀释，在聚合和使用中无有机溶剂污染，具有广阔的应用前景和环保价值［10］.

离子凝胶化法中各个反应条件对微胶囊的影响较大［7］，不易形成稳定且形貌较好的微囊.水包水乳液法制备壳聚糖微囊在国内外期刊中少见有报道，本文选用CS和TPP作为反应材料，既避免了化学交联剂所带来的毒性的影响，而且能够得到形貌相对较好，且比较稳定的壳聚糖微囊［11］.

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

壳聚糖(CS，武汉及时雨科技有限公司)，多聚磷酸钠(TPP，国药集团化学试剂有限公司)，吐温80(Tween-80，国药集团化学试剂有限公司)，聚乙二醇20000(PEG 20000，国药集团化学试剂有限公司)，冰醋酸(HAc，国药集团化学试剂有限公司).

聚热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S型，巩义市予华仪器有限责任公司)，透射电子显微镜(TecnaiG2 20S-TWIN，FEI公司)，电子天平(AR2140型，上海奥豪斯仪器有限公司).

1.2 实验方法和制备原理

1.2.1 制备原理

壳聚糖和多聚磷酸盐的结构示意图见图1，壳聚糖分子中含有大量的-NH2［12］，酸溶液中被质子化，形成-而溶解;多聚磷酸钠分子上的多个负电基团可与壳聚糖分子中的大量-形成分子内和分子间的交联［13］，使壳聚糖分子沉析出来.由于TPP中含有多个PO-Na+基团，溶解于醋酸的壳聚糖分子链中含有，壳聚糖在酸性条件下发生质子化，伸展成线状，氨基暴露出来并变成带正电的-，与TPP中的-PO-结构单元通过静电作用聚合成囊［7］，二者发生反应:chitosan-+TPP-PO-→chitosan---OP-PP.并向壳聚糖溶液中加了Tween-80和PEG20000，使分散剂和助表面活性剂在壳聚糖和多聚磷酸钠这两种“水包水”溶液中形成界面膜，令水包水溶液反应更好的进行.

图1 壳聚糖和多聚磷酸钠的结构式Fig.1 Structural formula of chitosan and sodium polyphosphate

1.2.2 壳聚糖的预处理

称取一定量的壳聚糖粉末溶于冰醋酸水溶液中，37℃的恒温水浴中用恒温磁力搅拌器搅拌1h，用1 mol/L的NaOH调节pH值.冷却至室温，待气泡完全消失，4℃静置24 h，过滤备用.

1.2.3 传统离子凝胶化法壳聚糖微胶囊

将配制好的壳聚糖溶液倒入250 mL的3口烧瓶，25℃的恒温水浴中固定至恒速搅拌器上，通过滴液漏斗向壳聚糖醋酸溶液中缓慢滴加多聚磷酸钠溶液，低速搅拌，制得壳聚糖微胶囊.

1.2.4 “水包水”法制备壳聚糖微胶囊

将已经配制好的壳聚糖溶液倒入250 mL的3口烧瓶中，25℃的恒温水浴中固定至恒速搅拌器上，加入600 μL的Tween-80和一定量助表面活性剂PEG 20000，在1500 r/min的转速下高速搅拌30 min，使三者充分混合均匀.通过滴液漏斗向壳聚糖醋酸溶液中缓慢滴加多聚磷酸钠溶液，低速搅拌，制得壳聚糖微胶囊.

1.2.5 微胶囊形貌及粒径的分析表征

微胶囊的形貌和粒径是其两个重要的参数，本实验采用透射电子显微镜(TEM)观察微胶囊的结构和粒径.

2 结果与讨论

2.1 不同CS和TPP质量密度比对壳聚糖微囊成囊的影响

TPP是为反应的交联剂，为带正电荷的壳聚糖提供负电荷，通过二者之间的静电相互作用而成囊，故TPP的加入量，即TPP与CS的浓度的比会影响CS/TPP纳米微胶囊的成囊效果.不同浓度比的CS/TPP TEM 图见图2.由图2 可见，ρ(CS)=1.50 mg/mL，ρ(TPP)=0.50 mg/mL，即 ρ(CS)︰ ρ(TPP)=3︰1时，成囊效果较好.

图2 不同浓度比的CS和TPP时微囊的TEM图Fig.2 TEM images of the microcapsules with different concentration ratio of chitosan and tripolyphosphate

2.2 不同体积分数的醋酸对溶剂壳聚糖微囊成囊的影响

壳聚糖是自然界中唯一的碱性多糖，不溶于水及一般有机溶剂，但在有机酸的水溶液(pH＜6.5)中能溶解形成粘性溶液.作为反应的主要反应物，它的溶解度也会对成囊的多少带来很大影响.从图3中可见用体积分数为10%的醋酸为溶剂时，形成的胶囊较好，数量较多，因为更多的壳聚糖溶解可提供更多的-NH+3与TPP-PO-静电作用成囊.

图3 不同体积分数的醋酸作溶剂时微囊的TEM图Fig.3 TEM images of the microcapsules with different volume fraction of acetic acid as solvent

2.3 不同搅拌速度对壳聚糖成囊的影响

在制备微囊的过程中，若搅拌速度过大，易使壳聚糖和多聚磷酸根之间静电作用断裂，不利于二者凝结成囊，不同搅拌速度下制备微囊的TEM图见图4.由图4可见，当转速为300，400 r/min时，相比200 r/min时，微囊的成型性较好，但更高转速下几乎无微囊形成.或因转速过高，阻碍了壳聚糖中氨基正离子和多聚磷酸钠中磷酸根负离子的凝结聚合，无法交联;或因高速转动时溶液的过大的剪切力使形成的薄壁微囊破碎.

2.4 Tween-80对壳聚糖成囊的影响

图4 不同转速时微囊的TEM图Fig.4 TEM images of the microcapsules with different stirring speeds

分散剂的加入，有助于“水包水”溶液中的介质更好的分散而不易黏粘，加入和未加分散剂的微囊TEM图见图5.由图5中可见，加入 Tween-80和PEG 20000后，微囊的形态和粘黏性均较未加更好，说明带正电荷的壳聚糖和带负电荷的多聚磷酸根能在Tween-80和PEG 20000形成的“界面膜”上更好地凝结成囊.

图5 有无分散剂和助表面活性剂时TEM图Fig.5 TEM images of microcapsules with or without dispersant and cosurfactant

2.5 PEG20000的加入量对壳聚糖成囊的影响

PEG 20000的加入有助于降低界面张力，增加界面的柔韧性，使界面易于弯曲，有助于微乳形成［14］，不同质量的 PEG 20000形成的微囊图见图6.由图6可见，随着PEG 20000质量的增加，带正电荷的壳聚糖和带负电荷的多聚磷酸根在“界面膜”处通过静电作用而凝结成囊，这种作用使分散剂所形成的“界面膜”弯曲趋向球形，稳定性和单分散性增加.说明助表面活性剂的加入有助于壳聚糖微囊的形成，并能增加微囊的单分散性.

图6 不同质量聚乙二醇20000下微囊的TEM图Fig.6 TEM images of the microcapsules with different qualities of PEG 20000

2.6 搅拌速度对壳聚糖微囊成囊的影响

不同搅拌速度下微囊的TEM图见图7.图7中b)、c)中转速稍偏大，所形成的微囊型不好，由于搅拌速度过大阻碍了壳聚糖中氨基正离子和多聚磷酸钠中磷酸根负离子的凝结聚合，导致无法很好的静电凝结.

图7 转速不同时微囊的透射电子显微镜图Fig.7 TEM images of the microcapsules with different stirring speeds

2.7 pH值对壳聚糖微囊制备的影响

由于壳聚糖粘度较大不溶于水，pKa一般约为6.5，反应的 pH 值必须小于 6.5［15］.在酸性条件下，壳聚糖分子上的-NH2质子化而带正电荷，微囊化过程中，体系pH一般控制在3～6.实验中用乙酸对其溶解，故酸度对纳米胶囊的制备和成型均有一定的影响.不同pH下所形成的微囊如图8所示.由图8可见，pH=5.11时壳聚糖微囊的形貌较pH=3.00时更好，由于在pH较低时，壳聚糖的电离基本上被抑制.

图8 不同pH所形成的微囊的TEM图Fig.8 TEM images of the microcapsules with different pH

3 结语

本实验通过优化一种离子凝胶化成囊的方法，即“水包水”型离子凝胶法，在“水包水”溶液中形成一种“界面膜”的作用，由壳聚糖醋酸溶液和多聚磷酸钠水溶液二者的浓度差和用两水相混合物的离子凝结作用形成微囊.结果表明:在600μL分散剂Tween-80和0.0400g助表面活性剂PEG 20000的介质中，当转速为200 r/min，pH=5.11，ρ(CS)=1.50 mg/mL，ρ(TPP)=0.50 mg/mL，即 ρ(CS)︰ ρ(TPP)=3︰1时，成囊较好.但对微胶囊的形状、大小、均一性、单分散性等问题还需要进一步的研究.

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