磷酸化油菜秸秆纤维素吸附剂的制备和对牛血清白蛋白的吸附

李步海，石荧原

(中南民族大学化学与材料科学学院，分析化学国家民委重点实验室，武汉430074)

秸秆是地球上储量巨大的可再生资源，但秸秆中天然纤维素成分的结晶度高、分子间和分子内存在大量的氢键，难溶于大多数溶剂，是秸秆在应用开发中的最大障碍［1，2］.卢炜［3］以油菜秸秆为原料提取天然的纤维素，在离子液体中用马来酸酐等改性秸秆纤维素，并用于 Cu(II)、Cd(II)、Pb(II)和 Hg(II)的吸附，改性后的吸附剂对重金属离子的最大吸附量比未改性前提高了约2～3倍.但合成离子液体价格昂贵，改性操作繁杂费时.Mucalo M.R.等［4］用磷酸化纤维素制成一种新型生物吸附剂，用于吸附细胞色素C，较未磷酸化纤维素获得较好的吸附效果.

近年来，用吸附的方法分离和纯化蛋白质的研究主要通过静电作用、离子交换、氢键、亲和吸附选择性吸附或特异性结合目标蛋白［5］.Tanyolac D.等［6］利用多孔聚乙烯丁醛表面的－OH吸附牛血清白蛋白(BSA).胡杰等［7］利用磺化的聚甲基丙烯酸甲酯微球吸附BSA.张静等［8］利用辛巴蓝 F－3GA修饰的壳聚糖微球吸附BSA.吴晖等［9］研究了胶原固载Zr(Ⅳ)亲和吸附材料对牛血清蛋白的吸附特性.

本文选用新的基质－油菜秸秆纤维素，以二甲基甲酰胺为交联剂，用磷酸修饰制备一种新型生物吸附剂，并考察了吸附剂对BSA的吸附性能的影响因素.

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

荧光/磷光/发光光度计(LS－55型，美国 PE公司)，傅里叶红外光谱仪(NEXUS 470智能型，美国珀金一埃尔默公司)，X射线光电子能谱仪(VG Multilab 2000)，手提式中药粉碎机(青州天地中药设备厂)，精密酸度计(pHS－3C型，上海虹益仪表有限公司)，透射电子显微镜(Tecanai G220 S－TWIN，200 kv，FEI公司).

牛血清白蛋白BSA(Sigma公司)，二甲基甲酰胺(SY国药集团化学试剂有限公司)，磷酸(武汉化学试剂厂)，尿素(重庆化学试剂厂).

油菜秸秆取于武汉市周边田间，油菜秸秆用粉碎机打碎过筛，选取100～200目颗粒.

1.2 吸附剂的制备

1.2.1 油菜秸秆纤维素的预处理

干燥的油菜秸秆粉末先用甲苯－无水乙醇混合液脱尽蜡质.用去离子水80℃浸2 h过滤.未滤过的物质用次氯酸钠处理.以10% 醋酸调pH为0.4～3.8，75℃加热2 h.过滤后20℃以10%NaOH提取10 h再过滤.用去离子水洗至pH中性，再用95%乙醇洗，50℃真空干燥16 h备用.

1.2.2 磷酸化油菜秸秆纤维素吸附剂的制备

取5.028 g预处理后油菜秸秆纤维素粉于500 mL圆底烧瓶中，加入200 mL二甲基甲酰胺，40.2 g尿素，33.9 g磷酸溶液，于205℃下反应2 h.水洗至中性，40℃下真空干燥20 h得磷酸化油菜秸秆纤维素吸附剂.

1.3 油菜秸秆纤维素吸附剂的表征

1.3.1 红外光谱

用KBr压片，FTIR检测400～4000 cm－1处的光谱吸收，观察修饰前后油菜秸秆纤维素粉表面官能团的变化.

1.3.2 TEM 表征

样品与无水乙醇混合后超声分散，用毛细管吸取样品溶液滴于表面附有碳膜的铜网上，待样品晾干后，进行TEM测试，观察微球的粒径大小和分布情况.

1.3.3 XPS 能谱

用XPS分析修饰前后吸附剂表面的各元素组成的变化(主要为O，P和C)，干燥的样品表面在10～8 托真空度条件下，用 3.6 keV Mg X－ray分析，谱图用284.6 eV 的C1s基碳峰校正，Avantage 4.54软件拟合.

1.4 吸附试验

分别称取20.0 mg磷酸化改性和原始油菜秸秆粉微球，置于25 mL锥形瓶中，加10.0 mL不同pH值缓冲溶液，0.4 mg/mL的 BSA，放入摇床(转速120 r/min)吸附20 h后离心.用荧光分光光度法测定上清液中剩余牛血清白蛋白的浓度.按式(1)计算吸附剂吸附率E.

式中C0为吸附溶液中加入的BSA初始浓度(mg/mL)，Ce为吸附后上清液中BSA的浓度(mg/mL).

1.5 洗脱实验

吸附完毕后离心，弃上清液，加入10.0 mL洗脱剂溶液，将锥形瓶放入摇床(转速120 r/min)振荡洗脱，20 h后离心.取上清液测定洗脱下来的目标组分的含量，按式(2)计算洗脱率W.

式中C1为洗脱液中BSA浓度(mg/mL).

2 结果与讨论

2.1 吸附剂的表征

2.1.1 红外光谱分析

图1 未修饰和修饰后秸秆粉的红外光谱Fig.1 FTIR spectra of cole straw before and after modification

未修饰和修饰后的秸秆粉红外光谱如图1所示.由图1可见，3421 cm－1为O－H的伸缩振动吸收峰，修饰后明显减弱，表明－OH参与修饰反应，修饰后的秸秆纤维素红外光谱在1052 cm－1有P－O伸缩振动，并且峰较修饰前明显，说明秸秆纤维素已成功磷酸化.

2.1.2 透射电子显微镜表征(TEM)

未修饰和修饰后的秸秆TEM图如图2所示.由图2可见，未修饰前秸秆粉表面光滑规整，修饰后秸秆粉层次较薄，表面不规整，有毛绒化，碎片化等明显特征.这是因为秸秆粉在修饰反应后，表面结构分解碎裂造成表面损伤.说明吸附剂修饰后，表面增加了一定数量的活性基团，表面积增大了.

图2 秸秆粉的透射电子显微镜图谱Fig.2 TEM of cole straw before and after modification

2.1.3 XPS 能谱分析

修饰前后秸秆粉吸附剂表面C、O、P三种元素的面积之比见表1.如表1所示，修饰后吸附剂表面各元素的比例发生了较大变化，氧元素的比例提高很大，由原来的16.56%提高到33.81%，磷元素由0.28%提高到0.58%.原因是经修饰后，纤维素吸附剂表面增加了大量的磷酸基等活性基团，氧、磷元素的比例也相应增加;并有明显的P2p峰，表明元素P成功地修饰到了秸秆粉吸附剂的表面，与红外解析一致，见图3.

表1 未修饰和修饰后秸秆粉吸附剂各元素比例比较Tab.1 Comparison of element proportions of the biomass before and after modification

图3 未修饰和修饰后秸秆粉吸附剂的能谱图Fig.3 XPS scan of the unmodified and modified biomass

2.2 不同条件对磷酸化油菜秸秆纤维素粉微球吸附BSA的影响

2.2.1 溶液pH 的影响

溶液pH对BSA吸附率的影响见图4.由图4可见，随着溶液pH值的增大，纤维素对BSA的吸附率先增大后减小.修饰后纤维素粉在溶液pH值为6时达到最大吸附率.BSA的等电点约为pH值4.8，当溶液pH值低于4.8时，BSA带正电荷，吸附剂表面由于羧基的离群，表面带负电荷，此时吸附剂与蛋白质之间的作用以静电引力为主;在等电点附近时，BSA呈电中性，此时，疏水作用成为吸附的主要驱动力，因此吸附率继续增大;在pH值为6时达到最大.当溶液pH值继续增大时，蛋白质表面所带负电荷增多，吸附剂与蛋白质之间的静电斥力使其吸附率降低.原始油菜秸秆纤维素粉表面的活性基团较少，在低pH时(＜蛋白质的PI)，静电引力较小，故吸附率较低.

图4 溶液pH与BSA吸附率的关系Fig.4 Effect of pH on BSA adsorption efficiency

2.2.2 吸附时间的影响

不同的吸附时间对磷酸化油菜秸秆纤维素粉的吸附性能的影响见图5.如图5所示.修饰纤维素粉在吸附进行15 h后达到吸附平衡，原始纤维素粉在吸附20 h后达到平衡.根据不同吸附剂的性质，确定后续实验吸附时间为20 h.因为修饰后吸附剂相比修饰前，表面有更多的活性基团，能更快达到吸附平衡.

图5 反应时间与BSA吸附率的关系Fig.5 Effect of contact time on BSA adsorption efficiency

2.2.3 BSA 初始浓度的影响

牛血清白蛋白的初始浓度与未修饰、磷酸修饰纤维素粉吸附量的关系见图6.由图6可见，随着牛血清白蛋白初始浓度的增加，两种吸附剂的吸附量逐渐增加.趋于吸附饱和后，吸附量基本不变.未修饰纤维素粉在牛血清白蛋白初始浓度为0.7 mg/mL时，达到最大吸附容量值68.98 mg/g;磷酸修饰纤维素粉在0.9 mg/mL，吸附容量达最大值127.39 mg/g，是未修饰的1.85倍.

图6 BSA初始浓度与吸附量的关系Fig.6 Effect of BSA initial concentration on adsorption capacity

用 Langmuir［10］和 Freundlich［11］方程模拟 2 种吸附剂的吸附过程，所得相关系数列于表2.从模拟结果可见，Langmuir模型所得直线的相关系数优于Freundlich模型，用Langmuir模型方程式算出的未修饰和修饰后的吸附剂最大吸附容量的理论值(73.96、133.51mg/g)和 实 验 值 (68.98、127.39 mg/g)能较好的吻合，故油菜秸秆纤维素吸附剂和磷酸修饰纤维素吸附剂对BSA的吸附过程可能只存在一种类型的吸附机制，两种吸附剂对BSA的吸附为单分子层吸附(图7).

Langmuir等温吸附方程为:

线型方程为:

qe平衡吸附量mg/g;Ce平衡浓度mg/L;qm是理论最大吸附量mg/g.

Freundlich等温式是一个经验公式，没有假设条件，方程式如下:

线性方程为:

其中，K(L/mg)和n是经验常数，qe(mg/g)是平衡时的吸附容量，Ce(mg/L)是吸附平衡时溶液中吸附质的浓度.

表2 纤维素对BSA吸附的Langmuir和Freundlich吸附等温线模拟参数Tab.2 Langmuir and Freundlich parameters for the absorption of BSA

图7 Langmuir和Freundlich吸附等温线模拟图Fig.7 Langmuir and Freundlich isotherms for BSA adsorption

2.2.4 吸附温度

25～45℃时，温度对牛血清白蛋白吸附率的影响不大，但温度的升高使部分蛋白质变性，为保持较高的活性和方便操作，吸附温度选定25℃.

2.2.5 离子强度的影响

NaCl浓度对BSA吸附率的影响见图8.由图8可见，随着溶液中NaCl浓度的增大，2种吸附剂对BSA的吸附率均明显下降.因为离子强度增加，双电层增厚，蛋白质与吸附剂结合的空间阻碍和静电排斥力加大;此外，溶液中离子浓度高时或极性增加时，蛋白质得到更大的稳定性，平衡往脱附方向移动，造成吸附率降低.

图8 NaCl浓度对BSA吸附率的影响Fig.8 Effect of NaCl concentration on adsorption ratio

2.2.6 BSA 的洗脱

NaCl和NaSCN溶液在不同浓度下作为洗脱剂对BSA的洗脱效果见图9.由图9可见，随洗脱剂浓度的增加，洗脱率增大，当 c(NaCl)＞1.0 mol/L，c(NaSCN)＞0.8 mol/L后洗脱率下降，NaCl和NaSCN的最大洗脱率分别为54.68%，42.26%.NaCl对BSA的脱附效果更好.这是因为盐浓度升高，离子强度增大，双电层增厚，BSA与吸附剂配体间的静电结合力和疏水作用减弱.其次，Cl－1相比SCN－1更活跃与自由，故能更好地稳定蛋白质.

图9 不同洗脱剂对BSA洗脱率的影响Fig.9 Effect of varying eluants on BSA elution ratio

3 结语

用磷酸化油菜秸秆纤维素粉微球，制备的生物吸附剂可选择吸附BSA.因其表面有更多的活性基团，其具有吸附平衡快，吸附容量大等优点.实验结果表明磷酸化油菜秸秆纤维素粉微球对BSA的最大吸附容量为127.39 mg/g，而未修饰油菜秸秆纤维素粉微球对BSA的最大吸附容量只有68.98 mg/g，表明改性能获得较好的吸附性能.吸附剂的吸附等温线符合Langmuir方程，属单分子层吸附.

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