雷帕霉素与大鼠肝纤维化演变的相关研究

钟志宏，戴 东，陈土明，吴祖超

（广东医学院附属医院 肝胆外科，广东 湛江524001）

转化生长因子（TGF－β1）是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF－β超家族，研究显示TGF－β1在肝纤维化的发生发展中起着重要的作用。本实验选择大鼠肝纤维化模型，应用mTOR受体抑制剂雷帕霉素（RAPA）治疗，观察其对大鼠肝脏TGF－β1的表达及雷帕霉素对肝纤维化的影响，探讨雷帕霉素在肝纤维化演变中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型的制备 成年健康雄性SD大鼠24只，体重200－250g，由广东医学院动物实验中心提供。按四氯化碳油（CCl4油）诱导建立大鼠肝纤维化模型。

1.2 实验方法 24只SD大鼠随机分为3组：正常对照组（A组）、肝纤维化模型组（B组）、雷帕霉素组（C组）每组8只。B、C组建立模型；C组按雷帕霉素2mg／kg体重胃内灌灌注，每天1次，持续2周。A、B组按同剂量予生理盐水灌胃，每天1次，持续2周。同期处死取肝脏组织切片，对肝组织切片分别行HE染色及免疫组织化学法处理，相片用Imagepro plus 6.0图像分析软件处理。

1.3 统计学分析

使用SPSS 17.0统计软件处理数据。计量资料用均数±标准差（±s）表示。组间比较采用独立样本的t检验。实验各组间比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）

2 结果

2.1 HE染色对肝脏组织的变化 见图1。

2.2 雷帕霉素对肝脏TGF－β1表达 见图2，表1。

图1 HE染色对肝脏组织的变化

图2 雷帕霉素对肝脏TGF－β1表达

表1 大鼠肝脏组织TGF－β1的阳性表达

3 讨论

近年来研究发现，TGF－β1可促进肝纤维化，通过TGF／Smad信号通路进行调控ECM的沉积，TGF－β1的大量表达，促使ECM过度沉积，加速肝纤维化。在肝硬化形成过程中抑制、缓解及延缓病程发展是基础与临床研究的重点。本实验病理HE染色及免疫组织化学结果观察到，模型组中肝纤维化明显，纤维间隔穿插其中；应用雷帕霉素2周后，TGF－β1表达明显下降，纤维间隔程度也较模型组减少。结果显示，雷帕霉素可抑制纤维肝大鼠肝组织中TGF－β1表达。TGF－β在正常肝脏组织中转录水平很低，而在肝纤维化模型中，在大多数的间充质细胞、单核细胞、肝细胞中TGF－βRNA转录处于高水平，TGF－β家族中尤以TGF－β1在肝纤维化的发生发展中有着重要的作用［1］。相关资料对HSC凋亡的调节因子主要有抑制HSC凋亡的生长因子如TNF－α、TGF－β、IFN－α、leptin 等［2］，而细胞因子中只有TGF－β能刺激HSC合成胶原纤维，而其他细胞因子仅刺激HSC增殖［3］，TGF－β通过TGF／Smad信号通路进行调控ECM的沉积。在肝纤维化进展期中，Kupffer Cell（KC）通过自分泌或旁分泌途径分泌大量TGF－β1，同时增加HSC上血小板衍生因子（PDGF）受体表达，通过自分泌循环分泌TGF－β1和PDGF，使HSC持续活化，抑制其凋亡。大鼠星状细胞体外培养活化后形态类似成纤维细胞，有研究者认为，HSC是成纤维细胞前体，在肝损伤时HSC活化转变为成纤维细胞，分泌ECM、细胞因子和蛋白酶抑制剂等成分参与肝纤维化进展［4］。雷帕霉素改善肝纤维化，与多途径调控TGF－β1表达相关。RAPA作为PI3K／AKT／mTOR信号通路抑制剂，抑制其激酶活性，阻断其细胞通路，抑制下游S6K1和4EBP1的磷酸化，从而抑制细胞分化和增殖［5－7］。KC作为肝脏固定于肝窦窦壁的巨噬细胞，RAPA阻断 巨噬细胞的PI3K／AKT／mTOR通路，减少细胞因子如 TNF－α、TGF－β1等的释放，抑制HSC增殖活化，促进HSC的凋亡，减少HSC转化为成纤维细胞，使ECM沉积减轻。单侧输尿管梗阻的老鼠模型中，通过封闭mTOR信号通路，抑制巨噬细胞和肌成纤维细胞，可以有效的改善患侧肾脏的纤维化［8］。RAPA也可以直接作用于HSC的Fas／Fasl系统，抑制细胞周期凋亡相关基因Bcl－2的转录，促进Fas／FasL系统中的重要因子Fas的表达，同时促进凋亡基因P53表达增多，启动Fas／FasL凋亡通路，上调P53、下调Bcl－2的表达实现HSC凋亡，抑制增殖［9，10］，减少 ECM 的沉积。本实验通过应用mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素，检测大鼠肝脏组织的病理形态改变及TGF－β1的表达，探讨雷帕霉素在肝纤维化进展中相关作用，实验结果显示：应用雷帕霉素大鼠，肝组织TGF－β1的表达明显降低，肝脏组织纤维化得以改善。

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