趋化因子受体CCR7在乳腺癌细胞株上的表达及意义

郭满盈，张 茵，罗雪平，陈 扬，王 栋

（解放军第98医院1.检验科；2.院部，浙江 湖州313000；3.第二军医大学解剖学教研室，上海200433）

多种趋化因子及其受体与恶性肿瘤的生长、浸润及转移有关，乳腺癌等多种肿瘤细胞表面有CCR5、CXCR4等趋化因子受体的表达，而且所表达趋化因子受体的不同可能与特定靶器官的定向转移有关［1－2］。趋化因子受体CCR7是否参与乳腺癌转移，作用如何，尚无定论。本组对乳腺癌细胞株MDA－MB－361上CCR7的表达进行了检测，为乳腺癌细胞转移机制的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 乳腺癌细胞株 MDA－MB－361由第二军医大学解剖学教研室常规传代培养。

1.1.2 主要试剂 Trizol RNA提取试剂盒，购自Life Technologies公司；CCR7mRNA引物由上海生物工程公司合成；M－MLV 逆转录酶、DTT、DEPC等购自 Gibco公司；Oligo－dT15购自Promega公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs购自TakaRa公司；鼠抗人CCR7mAb购自RD公司；免疫组化用第二抗体试剂盒购自美国LABvision公司。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌细胞株CCR7mRNA的检测 取1×106乳腺癌细胞，按照Trizol RNA提取试剂盒说明提取细胞总RNA，取6μg总RNA与0.5μg oligodT15混合，逆转录获得cDNA。以其作为模板，PCR扩增CCR7中一大小为530bp的片段，所用的上游引物为5′－TCCTTCTCATCAGCAAGCTGT－3′，下游引物 为 5′－GAGGCAGCCCAGGTCCTTGAAG－3′。具体反应步骤为：37℃ 1h，72℃ 5 min，完成逆转录；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环完成PCR后，再72℃充分延伸10min。以人GAPDH作为内对照，其上游引物为5＇－GGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG－3＇，下游引物为5＇－CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC－3＇，大小为788bp。扩增产物进行1.5g／L琼脂糖凝胶电泳，以GAPDH作为内对照，凝胶成像扫描仪分析，比较乳腺癌细胞中CCR7的相对表达量。

1.2.2 乳腺癌细胞株CCR7蛋白的检测 干净的盖玻片放入培养皿中，使细胞贴壁在盖玻上，培养24h，取出盖玻片，经PBS洗后，用4%多聚甲醛固定30min，85%、95%和100%乙醇脱水，用中性树脂将盖玻片无细胞面贴在载玻片上，经风干后可做免疫组化。主要步骤如下：①0.3%H2O2室温反应20min，或3%H2O2室温反应5min，用以清除内源性过氧化物酶反应，PBS浸泡5min。② 加工作浓度的一抗（约10μg／ml），37℃，1h，PBS冲洗3×3min。③ 加生物素化羊抗鼠IgG，37℃，30min，PBS冲洗3×3min。④ 加Streptavidin－HRP，37℃，30min，PBS冲洗3×3min。⑤ DAB染色，5－10min，水洗。⑥ 苏木素衬染，树脂封片，镜检。阳性结果判断为细胞膜、浆上呈棕褐色，背景为淡蓝色。

2 结果

2.1 乳腺癌细胞株CCR7mRNA的表达 通过RT－PCR法能从乳腺癌细胞株 MDA－MB－361中扩增出GAPDH基因片段和CCR7中选定的基因片段，以GAPDH作为内对照，凝胶成像扫描仪分析，比较乳腺癌细胞中CCR7的相对表达量为1.56，见图1。

图1 乳腺癌细胞株CCR7mRNA的表达（条带1）

2.2 乳腺癌细胞株CCR7的蛋白表达 免疫组化法检测到乳腺癌细胞株 MDA－MB－361细胞膜、细胞浆上有CCR7的蛋白表达，见图2。

图2 乳腺癌细胞株细胞膜、细胞浆上CCR7的蛋白表达（200×）

3 讨论

CCR7早先称为孤儿受体EBI1，最初是由于B细胞感染EB病毒而被发现，在幼稚T细胞（naive T）、B细胞及树突状细胞（dendritic cells，DC）表面表达，随DC的成熟，CCR7的表达也上调。CCR7及其配体CCL19、CCL21在淋巴器官的生长发育以及淋巴细胞、树突状细胞向淋巴结的归巢中发挥重要的作用［3］。Muller等［4］首次提出肿瘤细胞利用趋化因子受体与其配体的特异性结合而实现靶向性转移的理论，乳腺癌细胞可能利用与淋巴细胞、树突状细胞向淋巴结归巢一样的机制，即通过细胞表面的CCR7和淋巴结表达的CCL19、CCL21特异性结合来实现向淋巴结的转移。

本检测结果表明，乳腺癌细胞系MDA－MB－361高表达CCR7，其高表达可为下一步的实验研究打下基础。本组也曾发现乳腺癌组织中有CCR7的表达，而且在原位癌组织与发生转移癌组织中其表达率无显著性差异，说明CCR7在乳腺癌发生的早、中期就可能发挥作用［2］。

CCR7在癌细胞转移动态过程中具体作用尚待进一步探讨，对高表达CCR7的乳腺癌细胞系的进一步实验研究可能会有助于更多机制的发现。

［1］吴高松，马小鹏，刘岩岩，等.趋化因子SDF－1a生物半衰期预测乳腺癌术后复发及转移［J］.中华普通外科杂志，2010，25（11）：907.

［2］郭满盈，罗媛烨，陈 扬，等.趋化因子受体CCR6及CCR7在乳腺癌组织上的表达与意义［J］.国际检验医学杂志，2009，30（1）：28.

［3］杨银龙，欧周罗，邵志敏.CCL19／21－CCR7生物学轴与肿瘤转移［J］.国际肿瘤学杂志，2006，33（8）：564.

［4］Muller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis［J］.Nature，2001，410（6824）：50.