参麦注射液对阿霉素所致心肌细胞损伤的保护作用

陈 昕，赵 雷，孙 波，韩蕴琪，石 毅，周余来

（暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院1.检验科；2.麻醉科，广东 深圳518020；3.吉林大学药学院生物工程教研室，吉林 长春130021）

在细胞水平进行心肌损伤保护研究是近年热点，其最大优点在于排除了体内心脏实验模型中全身神经体液等的影响，以及心脏不同类型细胞间的相互作 用［1，2］。阿霉素（adriamycin，ADM）属蒽环类抗肿瘤药，临床上用于白血病、淋巴瘤、硬癌等的治疗，效果显著，但长期应用可发生心脏毒性效应，其临床应用受到限制［3］。本研究考察了阿霉素对原代培养的Wistar大乳鼠心肌细胞的损伤作用，并观察参麦注射液（SMI）对此损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

出生24h内Wistar大鼠，清洁级，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供（动物饲养合格证号：NO：0010281）；新生小牛血清、MEM 培养基由GIBCO公司提供；胰蛋白酶由HYCLONE公司提供；盐酸阿霉素为浙江海正药业股份有限公司产品（产品批号：061102）；参麦注射液为河北神威药业有限公司产品（产品批号：070216）；乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒、一氧化氮合成酶（NOS）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒为南京建成生物有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 乳鼠心肌原代培养 取出生24h内的Wistar大鼠心肌细胞培养于MEM培养液中，加入10%灭活胎牛血清，细胞浓度1×105／ml，每孔200 μl接种至96孔板中，37℃，5%CO2培养箱内培养。24h后观察细胞，当心肌细胞贴壁后，换液。在培养48h后，可见心肌细胞连接成片，并产生有节律的自主跳动。

1.2.2 实验分组及造模给药 细胞培养48h，将培养的细胞分组给药。空白对照组加MEM培养液培养；损伤模型组加阿霉素浓度为2μg／ml的MEM培养液培养；参麦注射液保护组分设3个浓度梯度，分别为100μl 10μg／ml的参麦注射液保护培养液＋100μl 2μg／ml阿霉素损伤培养液、100μl 20μg／ml的参麦注射液保护培养液＋100μl 2μg／ml阿霉素损伤培养液和100μl 40μg／ml的参麦注射液保护培养液＋100μl 2μg／ml阿霉素损伤培养液。

1.3 指标检测

1.3.1 细胞形态学观察

心肌细胞培养24h后，在倒置相差显微镜下观察细胞的形态，细胞的生长状态以及细胞的搏动率。

1.3.2 细胞损伤生化指标测定 在心肌细胞给药培养48h后，按试剂盒说明书检测培养液上清LDHI和NOS含量；检测培养心肌细胞超声破碎得到细胞混悬液检测MDA的含量。

1.4 统计学处理

数据用统计学软件SPSS V13.0进行处理。数据以±s表示，两组间均数的比较用t检验。多组间的比较用单因素方差分析，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有非常显著性差异。

2 结果

2.1 心肌细胞的形态学观察

空白对照组心肌细胞生长状态良好，细胞边缘清晰，相互连接成片，搏动节律一致，搏动频率为60－80次／min。损伤模型组细胞形态改变明显，细胞皱缩，细胞的边缘不清晰，细胞间的连接被破坏，自主节律跳动变为非同步的节律不齐的跳动，搏动频率为30－40次／min。药物保护组心肌细胞未裂解，仍有自主性搏动，但细胞仍有部分损伤。搏动频率为40－60次／min。

2.2 参麦注射液对阿霉素致心肌损伤的保护作用

各组细胞给药后培养达48h时，损伤对照组心肌细胞培养基中LDH、NOS和MDA含量明显增加，与正常组比较差异非常显著（P＜0.01）；而在参麦注射液3个剂量保护组，LDH和NOS含量较ADM损伤模型组依次降低，且降低呈现剂量依赖性；在参麦注射液保护低剂量组MDA指标改善不明显，而中、高剂量组与ADM组比较MDA含量明显改善，见表1。

表1 不同浓度参麦注射液对心肌细胞的影响

3 讨论

阿霉素是一种临床上广泛应用的抗癌药物，对乳腺癌、肝癌、白血病、卵巢癌等有较好的疗效，是治疗实体肿瘤最有效的药物之一［3］。但在它的药物代谢过程中会产生大量自由基，对人体各器官（尤其是心脏）产生毒性作用。阿霉素在心肌细胞中通过细胞色素P450和黄素单氧合酶转化为半醌阿霉素。半醌阿霉素具有毒性，并可与分子氧相互作用，触发级联反应，产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS与脂质、蛋白质和其他的细胞成分相互作用，导致线粒体和心肌细胞膜的损伤，使细胞膜脂质过氧化增强、蛋白质的功能受抑制、核酸和染色体被破坏，从而严重影响细胞各种功能［4］。本研究应用培养的心肌细胞观察了ADM对心肌细胞的损伤作用，结果显示，ADM可使培养的心肌细胞细胞形态改变明显，细胞的边缘不清晰，细胞间的连接被破坏，自主节律跳动消失，变为非同步的节律不齐的跳动；ADM损伤组乳酸脱氢酶（LDH）含量、一氧化氮合酶（NOS）含量、丙二醛（MDA）含量明显高于空白对照组。

在正常情况下，体内存在清除自由基和抑制自由基的酶体系（如SOD、CAT等），使之维持自由基产生和清除的动态平衡，防止自由基损伤［4］。为了减轻阿霉素的毒副作用，寻找有效的心脏保护药物，对发挥阿霉素的抗癌效果具有重要的意义。有研究表明，参麦注射液能够降低阿霉素所致心肌损伤，对心肌细胞起到了有效的保护作用［5］。

参麦注射液源自古方“生脉散”，主要成分为人参和麦冬。中医认为有益气固脱、养阴生津之功效。临床及药理研究显示其具有强壮抗疲劳、抗放射、促进造血功能、保护心肌抗休克以及增强免疫功能等作用［6］。麦冬含多种抗氧化物质，如皂苷、黄酮、多糖以及铜、锌等微量元素，均有不同程度清除自由基作用。人参有效成分人参皂苷有明显的心肌保护作用，它能够抑制缺血再灌注损伤，减少心肌酶的漏出量。人参甲醇提取物中的麦芽醇、水杨酸、草香酸有明显的抗脂质过氧化作用。麦芽醇不仅能捕捉自由基，具有抗氧化作用，该化合物可以减少膜蛋白分子中巯基的外露，从而稳定了膜蛋白的结构［5］。

本实验采用乳鼠心脏细胞体外培养技术并从细胞形态学、乳酸脱氢酶含量、一氧化氮合成酶含量、丙二醛含量等方面观察了参麦注射液对ADM中毒心肌细胞的保护。体外培养的心肌细胞经阿霉素造成损伤后，其代谢和功能等都受到影响，其中LDH的外漏可作为损伤判断的重要依据。LDH一直被认为是细胞能量代谢的标志性酶之一。LDH产生于线粒体，心肌细胞培养液之中的LDH是由线粒体膜破裂导致酶外漏而产生的［7］。很多实验资料说明，阿霉素对心肌的毒性效应来源于氧自由基，线粒体是其心脏毒性的主要部位［8］。与ADM同时给予的不同浓度的参麦注射液不同程度地减少了由于ADM损伤造成的LDH的漏出，改善了中毒心肌细胞的搏动频率。参麦注射液对ADM中毒的心肌细胞的保护作用与其改善线粒体酶功能有关，加强氧化磷酸化过程，提高所需能量，从而维持了心肌细胞节律性搏动等重要生理功能［9］。本研究表明参麦注射液可保护阿霉素引起的心肌细胞损伤，减少乳酸脱氢酶的漏出和改善心肌细胞的搏动情况，其机制与保护心肌细胞线粒体有关。

一氧化氮合酶（NOS）是另一衡量心肌细胞代谢状态的重要指标，可由阿霉素诱导产生。有研究发现，一氧化氮合酶（NOS）可使细胞产生NO增加，与阿霉素致心肌细胞产生增加的O2－反应生成过氧亚硝基阴离子（ONOO－）。ONOO－是一种强氧化剂，可迅速分解为高活性的OH－和NO等自由基，参与脂质过氧化。本实验中，损伤模型组的NOS含量高于空白对照组，说明损伤模型组心肌细胞受阿霉素氧化损伤后被诱导产生较多NOS。而在参麦注射液保护组，该指标明显较低，表示参麦注射液能够有效的抑制NOS的诱导产生，从而防止产生高活性的OH－和NO等自由基，抑制脂质过氧化，有效的保护了心肌细胞。

丙二醛（MDA）是脂质过氧化反应的主要的最终产物，可进攻蛋白分子的氨基，导致蛋白质的分子内交联和分子间交联，使细胞骨架蛋白结构和功能发生改变。MDA含量的增多，可表明脂质过氧化反应增强，间接反映了自由基产生的多少［10］。本实验结果显示，给予ADM后继续培养24h后，损伤模型组的MDA含量明显高于空白对照组，说明损伤模型组细胞经脂质过氧化损伤之后产生较多的MDA。参麦注射液保护组的MDA含量下降，与损伤模型组形成显著的差异，说明参麦注射液可以有效的抑制脂质过氧化反应，从而减少MDA的产生。

在本实验中将参麦注射液与ADM同时应用于培养的心肌细胞，可明显减轻ADM引起的损伤、保存细胞活力、维持相对规律的心肌搏动。参麦注射液对ADM引起的心肌细胞损伤有一定的保护作用，其机制与参麦注射液保护心肌细胞线粒体及其酶系统有关。在应用阿霉素等蒽环类药物抗肿瘤治疗的同时，辅以参麦注射液可以有效地控制ADM等引起的心脏毒性，为临床应用提供参考。

［1］柳 梅，张刚成，姚 艺.乳鼠心肌细胞的体外培养［J］.临床和实验医学杂志，2009，8（1）：3.

［2］何 蕾，张 莉，黄靖香.乳鼠心肌细胞的体外培养及生物学特性研究［J］.解放军医学杂志，2007，May.

［3］Tokarska－Schlattner M，Wallimann T，Schlattner U.Alterations in myocardial energy metabolism induced by the anti－cancer drug doxorubicin［J］.Comptes Rendus Biologies，2006，329（9）：657.

［4］Wim－Jan P.van Boven，Win B.Gerrisen，Antoine H.Driessen.Myocardial oxidative stress，and cell injury comparing three different techniques for coronary artery bypass graft［J］.European Journal of Cardio－Thoracic Surgery，2008，34（5）：969.

［5］李 茜，张文杰，马巧珍，等.参麦注射液治疗阿霉素致心脏毒性的心电图观察［J］.东南国防医药，2008，10（1）：43.

［6］戴 金，毛 威，阮善明，阿霉素心脏毒性的中医防治［J］.现代中西医结合杂志，2008，（22）：3485.

［7］Lisa Devillard，David Vandroux，Cindy Tissier，et al.Involvement of microtubules in the tolerance of cardiomyocytes to cold ischemia－reperfusion［J］.Molecular and Cellular Biochemistry，2007，307：149.

［8］Dealtey SM，Aksenov MY，Aksenova MV，et al.Adriamycin－induced changes of creatine kinase activity invivo and in cardiomyocyte culture［J］.Toxicology，1999，134：51.

［9］刘晓健，刘 义，胡长宏，等.参麦注射液对阿霉素所致心肌细胞毒性的影响［J］.中国现代药物应用，2008，2（7）：11.

［10］Zhong Zhao，Yang yang Zhang，Wen Ge，et al.Effect of ecdysterone on heteroptopic heart transplantation in rats［J］.Journal of Nanjing Medical University，2008，22（5）：299.