中国吉林省地区朝鲜族及汉族正常人群内皮型一氧化氮合酶基因4a／bVNTR多态性分布的比较研究

李 淼，李 冰，吴 琼，刘亚芳，丁奎成，全成实＊

（1.吉林大学第一医院 病理诊断中心，吉林 长春130021；2.吉林大学中日联谊医院 心血管内科，吉林 长春130033；3.吉林大学病理生物学教育部重点实验室，吉林 长春130021）

内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）为依赖钙调蛋白的血管内皮固有酶。eNOS经多步氧化还原反应产生一氧化氮（nitric oxide，NO），从而刺激血管平滑肌产生cGMP，进而维持血管的基础张力［1，2］。人类eNOS基因位于染色体7q35－36区，含26个外显子和25个内含子［1］，1994年 Miyahara K 等 人［3］发现eNOS 基 因内含子4上的27bp数目可变的串联重复序列（vari－able number of tandem repeats，VNTR），根据重复次数不同有两种等位基因，重复4次为a等位基因，重复5次为b等位基因。4a／bVNTR多态性形成了3种基因型aa、ab和bb。对eN0S基因4a／bVNTR多态性大量研究发现，eNOS基因多态性与心脑血管等疾病关联。目前，有关eNOS基因多态性的相关研究在中国汉族、蒙族和哈萨克族［4］中已有报道，但在中国朝鲜族人群eNOS基因4a／bVNTR多态性的研究尚未见报道。本研究应用PCR等技术，分析了我国吉林省地区朝鲜族和汉族正常人群eNOS基因4a／bVNTR多态性的分布情况，为不同民族eNOS基因4a／bVNTR多态性分布与慢性病相关性的前瞻性研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象 经过体格检查及辅助检查，选取各项指标均在正常范围的吉林省地区正常人群共183人，其中朝鲜族92人（男性42人，女性50人），汉族91人（男性41人，女性50人）。年龄分布在40岁到76岁之间，平均年龄55岁。病史询问主要排除高血压病，糖尿病，心脑血管疾病，肿瘤等目前被证实与遗传有关的疾病。受检者采外周静脉血2ml，4℃保存至提取基因组DNA。

1.2 方法 采用PCR等技术对中国吉林省地区朝鲜族正常人群92人和汉族人群91人的eNOS基因4a／b VNTR多态性进行了检测，同时对其分布特征进行了分析。

1.2.1 基因组DNA提取 保存的含EDTA血样用淋巴细胞提取液（鼎国公司）进行淋巴细胞分离，然后常规进行基因组DNA提取。

1.2.2 PCR扩增eNOS基因的特异片断 参照文献［5］设计引物，引物序列如下；forward：5′－AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT－3′，reverse：5′－TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC－3′。引物由上海生工合成。用PCR试剂盒（TAKALA公司）进行PCR反应。PCR反应体系为20μl，其中含上下游引物各0.4μl，模板 DNA0.3μl，TagDNA 聚合酶混合物10μl，加去离子水9μl。在PCR扩增仪（PTC－100，MJ Reseach.公司）上进行如下循环：95℃热启动5min，95℃变性1min，57℃退火1 min，72℃延伸1min，共35个循环后72℃延伸7 min。取PCR扩增产物7μl，在4%的琼脂糖凝胶中电泳1h，在紫外照射仪上观察结果并摄影。

1.2.3 eNOS基因PCR扩增产物的分析及结果判定标准 eNOS基因型多态性表现为数目可变的串联重复序列（VNTR），6次重复等位基因的PCR扩增片断长447bp，包括162bp的重复序列（6＊27 bp）和285bp上下游侧翼序列；5次和4次重复等位基因的PCR产物分别为420bp和393bp，其中重复序列分别为135bp（5个27bp的重复序列）和108bp（4个27bp的重复序列）［6］。eNOS基因第4内含子上有两种等位基因，27bpVNTR重复4次为a等位基因，重复5次为b等位基因［7］。eNOS基因4a／bVNTR多态性形成了3种基因型aa，ab和bb。

1.2.4 统计学分析 以基因计数法计算正常人的基因型和等位基因频率。用χ2检验及 Hardy－Weinberg平衡评估标本的群体代表性。并用χ2检验评估等位基因及基因型频率的差异。应用SPSS1 2.0软件包作统计学处理。

2 结果

2.1 Hardy－Weinberg遗传平衡检验 经拟合优度χ2检验，eNOS4a／bVNTR基因的基因型频率在朝鲜族和汉族人群中的分布符合Hardy－Weinberg遗传平衡定律，P＞0.05，表明样本具有群体代表性。

2.2 吉林省地区朝鲜族和汉族健康人群eNOS4a／bVNTR基因型检测 eNOS基因的PCR产物为420bp和393bp，eNOS基因4a／bVNTR多态性形成了3种基因型aa，ab和bb，见图1。92例朝鲜族正常人群中，aa型4名，ab型28名，bb型60名，3种基因型的频率分别为0.043 48、0.304 3和0.652 2；在91例汉族正常人群中，aa型2名，ab型13名，bb型76名，3种基因型的频率分别为0.021 98、0.142 9和0.835 2。吉林省地区朝鲜族eNOS基因aa＋ab基因型频率显著高于汉族（χ2＝8.026，P＜0.01），见表1。

2.3 吉林省地区朝鲜族和汉族健康人群eNOS基因等位基因检测 吉林朝鲜族a和b两种等位频率分别为0.195 7和0.795 7；汉族a和b等位基因频率分别为0.093 4和0.906 6，两组差异均有统计学意义（χ2＝7.724，P＜0.01），见表1。

图1 eNOS基因多态性位点电泳图

表1 吉林朝族与汉族人群人eNOS基因4a／bVNTR多态性及等位基因分布

3 讨论

eNOS是左旋精氨酸一氧化氮途径的关键酶，其催化生成的NO具有舒张血管、调节血流、阻止肾素－血管紧张素的产生及抑制血小板聚集等作用［8］。目前认为，eNOS基因多态性与心脑血管等疾病关联。有关朝鲜族和汉族正常人群的基因4a／bVNTR多态性的研究尚未见报道。人类基因多态性具有种族差异，这种差异可以造成不同人群对某些疾病的易感性不同。人类疾病几乎都是遗传因素与环境因素相互作用的结果，只是二者所占的比重在不同的疾病中有所不同。

关于吉林省地区朝鲜族和汉族健康调查研究发现，朝鲜族心脑血管病的死亡率明显高于当地汉族［9］。这种差异可能与不良生活方式有关，但与遗传因素的关系尚未见研究报道。本实验结果显示，92例朝鲜族正常人群中，aa型4名，ab型28名，bb型60名，3种基因型的频率分别为0.043 48、0.304 3和0.652 2。91例汉族正常人群中，aa型2名，ab型13名，bb型76名，3种基因型的频率分别为0.021 98，0.142 9 和 0.835 2。eNOS 基 因 4a／bVNTR多态性在吉林朝鲜族和汉族间存在种族差异，朝鲜族aa＋ab基因型频率显著高于汉族，同时发现a等位基因频率明显高于汉族。提示朝鲜族和汉族eNOS基因多态性分布可能与人群的生活习惯等密切相关。黄惠彬等人［10］研究发现，eNOS基因27bp VNTR多态性与中国汉族人高血压的发生有关，携带重复a等位基因的人具有罹患高血压的危险性。他们认为eNOS基因27bp VNTR多态性a等位基因携带者血管内皮的NO合成减少，损伤阻力血管内皮细胞功能，引起外周血管阻力增加从而引起舒张压增高［11］。人们同时发现，NO的缺乏可以加速动脉粥样硬化的发展，eNOS基因的改变可影响NOS蛋白的功能及活性，从而降低NO的合成，加速动脉粥样硬化的发展［12］。Tsukada等［13］实，携带aa基因型者较bb基因型着血清NO水平降低23%，认为内含子4的多态性影响转录后mRNA的剪接过程，因而人群中不同的eNOS基因型有可能决定了不同个体间eNOS的表达与功能上的差异，进而影响到体内eNOS的生物学效应。鉴于中国人心血管病的发病率及死亡率均低于欧美国家，除环境、饮食等因素外，某些遗传因素或许起着重要的作用。因此，获得我国吉林省地区朝鲜族及汉族人群eNOS基因多态性位点的统计资料，对于进一步研究基因多态性与疾病的相关性将具有重要的应用价值。

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