小鼠急性氧化乐果中毒对c－fos在肌组织内表达的影响

刘晶瑶，谷丽娜，周春奎＊

（吉林大学白求恩第一医院1.二部 神经内科；2.急救医学科，吉林 长春130031）

骨骼肌即刻早期反应基因c－fos作为细胞早期快速反应基因家族的重要成员，在生理状态下，正常的生理需要可决定基因的表达，表现为它可控制细胞生长与分化的信号；在应激状态下，这些受基因调控的蛋白能够提高生物体的耐受性和应激能力，并起到重要的作用［1］。在我国农业生产中有机磷农药应用十分广泛，多年以来有关其中毒机制的研究较多，但关于在农药作用下c－fos表达的变化研究甚少。本研究采用免疫组化技术，在整体水平上观察了农药对这类基因表达的影响。以求进一步在形态学上探寻c－fos基因与中间期肌无力综合征（intermediate myasthenia syndrome，IMS）之间的关系。

1 材料与方法

1.1 动物来源

昆明小鼠93只，雄性，鼠龄：8周，体重：20±3g，健康活泼、皮毛有光泽，均由吉林大学实验动物中心提供。

1.2 主要的实验试剂和仪器

主要试剂：40%氧化乐果乳油，按1∶200蒸馏水稀释。硫酸阿托品注射液（每支：5mg·ml－1）。0.9%氯化钠注射液500ml若干瓶。实验仪器：物理天平，高速离心机，日立H7600全自动生化检测仪，1ml无菌注射器若干。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 空白对照组：昆明小鼠8只，不染毒也不给药。生理盐水对照组：共10只。实验组：按染毒后时间点（24h、48h、72h、96h及5－7d）分笼，15只／笼，按清洁级动物房常规饲养。

1.3.2 动物给药 生理盐水对照组：根据染毒剂量，应用等量生理盐水腹腔注射给药。实验组：每笼同时腹腔注射40%氧化乐果（50mg·kg－1）及阿托品（10mg·kg－1）。根据染毒后小鼠表现，当出现抽搐频繁、呼吸困难等严重并发症情况时，追加阿托品用量以渡过急性期［2］。

1.3.3 肌力测定 按时间点观察各组小鼠摄食、姿势和活动情况，其中对染毒后1－7d小鼠进行肌力测定。肌无力评定标准按Lennon等的分级法［1］，如下：0级：没有肌无力表现；1级：嘶咬无力，四肢力量较差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少；2级：明显无力，休息时脊背呈隆起姿势，头尾下垂、前肢趾弯曲，动作不协调；3级：严重无力表现，无嘶咬动作，肌肉震颤，呼吸困难，濒死或死亡。

1.3.4 小鼠腓肠肌内c－fos阳性细胞率的检测 取空白对照组小鼠8只、生理盐水对照组小鼠10只以及实验组中按染毒后各时间点随机抽取每笼6只或8只昆明小鼠断头处死，取腓肠肌组织，10%甲醛固定并行石蜡切片，采用S－P免疫组化染色方法进行免疫组化染色。切片观察及结果判定c－fos阳性表达为细胞核内呈现棕黄色颗粒.阴性细胞为蓝染。

1.4 图像分析 在光学显微镜（OLYMPUSBX51）下对每张玻片在400倍视野下任取5张，应用图像分析软件测量每张图片计数视野阳性细胞率（阳性细胞／视野内整个细胞数）。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。1－7 d各时间点小鼠出现肌无力百分率的比较采用χ2检验。各组c－fos阳性细胞率用均数±标准差表示，各组c－fos阳性细胞率组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 染毒后小鼠肌力变化

染毒后1－7d各时间点小鼠出现肌无力百分率最高在24h，主要集中在染毒后1－3d；5－7d出现肌无力发生率较低。通过χ2检验，染毒后1－4d出现肌无力百分率与5－7d比较差异有显著性（P＜0.05）（表1）。

2.2 染毒后小鼠肌肉组织c－fos表达的变化

染毒后1－4d发生肌无力小鼠腓肠肌细胞c－fos表达均有不同程度升高，与空白对照组、生理盐水对照组及正常肌力小鼠比较差异有显著性（P＜0.01）。正常肌力小鼠腓肠肌细胞c－fos阳性细胞率与空白对照组、生理盐水对照组比较差异无显著性。

表1 1－7d各时间点小鼠出现肌无力的百分率

表2 1－4d各时间点小鼠c－fos阳性细胞率变化（±s）

表2 1－4d各时间点小鼠c－fos阳性细胞率变化（±s）

注：与空白对照组及生理盐水对照组比较＊P＜0.01，与正常肌力组比较△P＜0.01

时间 n c－fos（%）空白对照组28 8.04＋3.13 8 7.25＋2.03生理盐水对照组 10 6.58＋2.11肌无力组 25 22.25＋7.65＊△正常肌力组

3 讨论

乙酰胆碱为中枢神经系统某些部位及胆碱能神经的化学传导介质。有机磷杀虫药的毒性作用在于能与胆碱酯酶结合成为磷酰化胆碱酯酶，后者性质稳定，失去分解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱在效应器的堆积，从而出现临床中毒症状。在有机磷农药中毒时，通过对胆碱酯酶活力的测定，对中毒程度判定有一定的参考价值。在前期研究阶段我们已对急性有机磷农药中毒小鼠进行了酶学动态观察［2］，在染毒后1－7d内，胆碱酯酶活力呈持续抑制状态，即无论是肌无力小鼠，还是非肌无力小鼠，其胆碱酯酶均受到明显抑制，并得出结论胆碱酯酶活力持续低下可能是IMS发生的启动因素，但不是IMS发生的直接原因。

c－fos基因是即刻早期基因的一种，fos蛋白为其表达产物。正常情况下。c－fos基因的表达是极低的，它的主要作用是参与细胞主要的生理功能，如生长、分化、信息传递、学习和记忆等生理功能。同时它还可调节神经生长因子、前脑啡肽、酪氨酸烃化酶、血管活性肠肽等其它后期反应基因的长期表达［3］，促使神经细胞的适应性变化，并能增强细胞的修复能力。同时在某些因素的刺激下，c－fos基因能被诱导快速表达.在细胞周期早期和生长相关步骤起作用。国外学者的实验结果表明，c－fos表达的增强与细胞凋亡密切相关。c－fos基因的特征为静止的细胞，当神经系统发生病变时，如受到外界如缺血、缺氧、癫痫、外伤和外周神经刺激等情况，在特定的脑区内能迅速表达［4］，同时各部位表达强弱也不同，但这种表达是短暂的，解除相应刺激后，其表达也很快消失。但当c－fos基因表达异常增加，还可干扰细胞增殖和凋亡的动态平衡，继而诱导细胞转化和肿瘤形成［5］。有研究表明。c－fos基因表达与脑缺血后神经元的死亡或凋亡呈平行关系，其表达程度反映了脑缺血后神经元死亡或凋亡的程度。c－fos基因表达越高，相应的脑组织损伤越严重［6］。何凤生等人［1］早在1999年针对急性有机磷中毒后肌无力的发生与c－fos基因表达进行了初步探讨，结果表明，有机磷农药的刺激可以快速诱导c－fos的表达。本研究主要针对急性有机磷中毒患者全部胆碱能危象消失后1－4天所发生的IMS是否与c－fos基因表达变化有关。结果表明，有机磷中毒1－4天组肌无力小鼠腓肠肌组织c－fos阳性细胞率明显高于对照组及正常肌力小鼠，而有机磷中毒后1－4天是IMS主要发病时期，因此这提示我们c－fos表达增高不光与急性期有机磷农药中毒快速诱导有关，而且还与急性期过后IMS的发生存在一定关系，更详细的发病机制有待于进一步的功能性基因研究。

［1］杨东仁，牛 勇，何凤生.c－fos基因在乐果中毒后肌无力大鼠肌组织中的表达［J］.卫生研究，1999，17（6）：373.

［2］刘晶瑶，周春奎，江新梅.小鼠急性氧化乐果中毒致肌无力的生化指标变化及意义［J］.临床神经病学，2009，22（5）：356.

［3］Buytaert KA，Kline AE，Montanez S，et al.The temporal pattern of c－fos and basic fibroblast grouth factor expression following a unilateral anteromedial cortex lesion［J］.Brain Res，2001，894：121.

［4］程景丽，和姬苓.脑缺血再灌注后c－fos基因表达与神经细胞凋亡关系的研究进展［J］.内蒙古医学杂志，2009，41（1）：65.

［5］David JP，Mehic D，Bakiri L，et al.Essential role of RSK2in c－fos dependent osteosarcoma development［J］.J Clin Invest，2005，115：664.

［6］Whitifield J，Neame SJ，Paquet L，et al.Dominant－negative c－Jun promotes neuronal survival by reducing BIM expression and inhibiting mitochondrial cytochrcmec release［J］.Neuron，2001，29（3）：629.