SFTPB、TACSTD1、PVA基因联合检测非小细胞肺癌淋巴结微转移的研究

陈文学 方选妹 黎文婷 齐淑轶 邹学森

肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占80%。肺癌的转移和复发是患者高死亡率的主要原因，而淋巴结转移是NSCLC转移的主要途径。肿瘤相关钙信号转导蛋白1(tumor-associated calcium signal transducer 1，TACSTD1)也称为上皮细胞粘附分子，在上皮癌变过程中发挥着作用，同时也被用于检测各种肿瘤的微转移［1-2］。寻常型天疱疮抗原(pemphigus vulgarisantigen，PVA)又称为桥粒芯糖蛋白3，是自身免疫性疾病天疱疮的血清学抗原，在头颈肿瘤中研究较多，近年来有报道其用于NSCLC淋巴结微转移的检测。表面活性蛋白B(surfactant protein B，SFTPB)是Ⅱ型肺泡细胞分泌的表面活性分子，同时也是肺腺癌淋巴结微转移检测指标之一。本研究通过荧光定量PCR技术检测NSCLC癌组织、组织学阳性的淋巴结及肺良性病变的淋巴结中的SFTPB、TACSTD1、PVA mRNA表达水平，研究其用于NSCLC淋巴结微转移检测的可行性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集我院2009年2月至2011年12月的40例非小细胞肺癌及淋巴结标本，其中男性28例，女性12例，平均年龄57.4岁。所有病例均为初治，行肺癌根治术加淋巴结清扫术，均有组织病理诊断证实。腺癌11例，鳞癌25例，其它类型4例(大细胞型肺癌3例，大细胞和小细胞混合型肺癌1例)。临床分期:Ⅰ期7例，Ⅱ期13例，Ⅲ期9例，Ⅳ期12例。取手术治疗20例非肺癌患者淋巴结20枚作为阴性对照。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 手术后标本30 min内取材，小心去除肿瘤和淋巴结上的脂肪组织和血凝块，用无RNA酶的水冲洗，去除可能污染的肿瘤细胞，每个淋巴结均分2份，一份送病理科进行常规病理检查，一份存放－80℃保存。

1.2.2 总 RNA提取、cDNA合成及 PCR扩增 总RNA提取使用RNA提取试剂盒(qiagen)，按说明书步骤操作，逆转录荧光定量检测使用试剂盒(takara)，引物在上海生物工程有限公司合成。为了保证逆转录PCR扩增产物的可靠性，设计上下游引物时跨内含子，每个逆转录cDNA产物均在内参基因扩增出后再进行扩增，设置空白对照和阴性对照管。

1.3 统计学处理

采用ΔCT法对目的基因进行相对表达量的分析［3］，ROC曲线分析肿瘤标志物敏感性、特异性，所有的统计分析均用SPSS10.0计算。

2 结果

2.1 SFTPB、TACSTD1、PVA 基因的表达情况

20例原发性NSCLC肺癌组织，20例组织学阳性淋巴结，20例肺良性疾病淋巴结的SFTPB、TACSTD1、PVA基因相对表达量的分析见图1。图中数据显示肿瘤组织与组织学阳性的淋巴结的基因表达水平无统计学意义，但与肺良性疾病淋巴结的基因表达水平差异显著(P＜0.05)。将良性淋巴结的最高表达值设为cutoff值(100.0%的特异性)，组织学阳性的淋巴结的敏感性分别为 SFTPB(45.7%)、TACSTD1(100.0%)、PVA(75.4%)。TACSTD1基因在阳性淋巴结与良性淋巴结之间的最小差异倍数为6.2倍。

图1 SFTPB、TACSTD1、PVA基因在NSCLC肺癌组织及淋巴结中表达情况

2.2 SFTPB、TACSTD1、PVA 基因在不同的组织学类型中的敏感性(表1)

NSCLC主要有3种不同的组织学类型，即腺癌、鳞癌、大细胞肺癌。在100.0%特异性时3种肿瘤标志物在不同的组织学类型中的敏感性各不相同，PVA对鳞癌的敏感性达到100.0%，SFTPB对腺癌的诊断敏感性达到83.2%，TACSTD1对鳞癌腺癌诊断的敏感性均为100.0%。

表1 SFTPB、TACSTD1、PVA基因在不同组织学类型中的敏感性

3 讨论

肺癌是我国常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升的趋势，而肺癌的5年生存率没有明显的提高，据文献报道进行了完全性切除术的Ⅰ期NSCLC患者总的5年生存率60%～70%［4］，患者多死于肺癌的转移或复发。因此肺癌的微转移检测对于肿瘤切除后分期、复发、转移及预后的判断具有重大意义。

目前判断肺癌是否淋巴结转移常用手段是病理检查，但是对于NSCLC的N分期的常规病理检查的准确性较低。有些肿瘤患者分期低，无明显转移证据，但在行癌根治术后却早期死于癌转移。这说明患者术前已存在用常规组织病理学方法不能检出的癌细胞播散或隐性淋巴结转移。这些微转移灶和循环癌细胞往往是肿瘤出现显性转移和复发的主要原因。因此对常规病理检查阴性的淋巴结用免疫组化或分子生物学技术进行检测，检测结果阳性则认为淋巴结有微转移。相对于免疫组化，逆转录PCR具有以下几个优点:①检测的敏感性高，免疫组化的敏感性仅能达到105［5］，而PCR 可达到106，甚至107［6］，较免疫组化高了 1～2 个数量级;②PCR为定性检查，只要为阳性结果就能明确肿瘤细胞的存在;③检测指标客观，主观因素影响小，而免疫组化需要根据颜色、百分比等判定结果，主观因素影响大。

Salerno等［7］应用RT-PCR技术检测MUC1基因，其预测NSCLC患者淋巴结微转移的敏感性为80%，冼磊等［8］对31例NSCLC患者病理检查阳性淋巴结检测MAGE基因1-4，至少1种表达阳性的敏感性达到87.1%。本研究通过荧光定量PCR技术检测NSCLC癌组织、组织学阳性的淋巴结及肺良性病变的淋巴结SFTPB、TACSTD1、PVA mRNA 表达水平，发现肺癌组织与组织学阳性的淋巴结表达水平相近，与肺良性病变淋巴结的表达水平有显著性差异。TACSTD1对诊断肺癌淋巴结转移具有较高的敏感性和特异性，可以作为独立的诊断指标。在组织学类型分类诊断中PVA对诊断鳞癌有较高的敏感性(100.0%)，SFTPB对诊断腺癌有较高的敏感性(83.2%)。因此SFTPB、TACSTD1、PVA基因联合检测可以作为肺癌淋巴结微转移的分子生物学指标。

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