油樟叶乙酸乙酯萃取物镇痛抗炎作用的研究

魏 琴，殷中琼，杜永华，周黎军，2，陶 翠，贾仁勇

（1.宜宾学院 发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川 宜宾644007；2.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川 宜宾644007；3.四川农业大学动物医学院，四川 雅安625014；4.四川农业大学 动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 雅安625014）

樟叶入药古已有之，《纲目拾遗》记载：樟树叶有祛风，除湿，止痛，杀虫之功效，主治风湿骨痛，跌打损伤，疥癣。现代研究表明，香樟（Cinnamomum.camphora）叶乙醇提取物具有明显抑菌作用［1］，樟叶甲醇提取物及其乙酸乙酯萃取物能抑制多种炎症因子的产率［2］。油樟［Cinnamomumlongepaniculatum（Gamble）N.Chao］是樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum）植物，主产于四川宜宾，其叶富含芳香油，每年提取油樟油后抛弃大量残渣副产物，不仅浪费资源，还污染环境。为充分利用与合理开发油樟副产物资源，本试验研究了油樟叶乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物的镇痛抗炎作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明系小鼠，雌雄各半，体重18～22g；SD大鼠，雌雄各半，体重180～220g，均由四川省医学科学院实验动物研究所提供。

1.2 药品和试剂 伊文思蓝（Evans blue）为国药集团化学试剂有限公司产品；角叉菜胶为美国Sigma公司产品；吲哚美辛为山西临汾奇林药业有限公司产品；冰乙酸为成都天华科技股份有限公司产品；二甲苯为湖北沙市化工试剂厂产品。

1.3 主要仪器 YLS－6A智能热板仪，山东省医学科学院设备站；MA200型电子分析天平，上海第二天平仪器厂。

1.4 油樟叶乙酸乙酯萃取物的制备 将提过挥发油的油樟叶残渣于45℃烘干，粉碎过20目筛，加入10倍量95%乙醇，85℃水浴回流8h，过滤，滤液浓缩得乙醇浸膏，将乙醇浸膏用水均匀分散，用石油醚萃取脱脂，水溶液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，浓缩干燥即得乙酸乙酯萃取物。将油樟叶乙酸乙酯萃取物用0.5%羧甲基纤维素（CMC）溶液超声溶解，配成125mg/mL、62.5mg/mL、31.25mg/mL溶液（以生药量计算），4℃备用。

1.5 镇痛作用

1.5.1 小鼠醋酸扭体试验［3］取小鼠50只，随机分成5组，每组10只，雌雄各半，其中3组为药物组，其余为羧甲基纤维素溶剂对照组和吲哚美辛对照组。各组均按体重给药，药物组剂量分别为2.5 g/kg、1.25g/kg、0.625g/kg；吲哚美辛对照组剂量为2mg/kg；溶剂对照组剂量为20mL/kg；连续灌胃给药4d，每天1次。各组小鼠末次灌胃后1h，每只小鼠按10mL/kg体重的剂量，腹腔注射0.7%冰醋酸溶液，记录小鼠20min内扭体反应（腹部内凹，伸展后肢，臀部抬高）次数。按下式计算扭体抑制率：抑制率（%）＝［（对照组扭体次数一给药组扭体次数）/对照组扭体次数］×100%。

1.5.2 小鼠电热板试验［3］小鼠置于（55.5℃±0.5℃）恒温热板上，以舔后足为指标，筛选痛阈值在5s～30s的小鼠50只，按“1.5.1”项分组及给药。末次灌胃30min后，分别于30、60、90、120min测定各小鼠灌胃后的痛阈值。在测定中，如60s内无痛反应，应立即取出，并以60s计算。按下式计算镇痛百分率计算公式：镇痛率（%）＝［（给药组痛阈值－对照组痛阈值）/对照组痛阈值］×100%。

1.6 抗炎作用

1.6.1 二甲苯诱导小鼠耳肿胀试验［4］取小鼠50只，按“1.5.1”项分组及给药。末次给药后1h于小鼠左耳前后两面涂抹二甲苯，每只0.02mL，右耳作对照，1h后将小鼠脱颈处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径6mm的打孔器分别在同一部位打下圆耳片，用分析天平称重，以左右耳片之差为肿胀度。按下式计算肿胀抑制率：抑制率（%）＝［（溶剂对照组肿胀度－药物组肿胀度）/溶剂对照组肿胀度］×100%。

1.6.2 醋酸诱导小鼠毛细血管通透性增高试验［5］按“1.5.1”项分组及给药。末次给药后1h，各小鼠均静脉注射5g/L伊文思蓝10mL/kg，随即腹腔注射6g/L醋酸0.2mL/只，20min后脱颈椎处死，腹腔注射生理盐水5mL，轻揉腹部0.5min，5min后剪开腹部肌肉，吸出腹腔洗涤液，3 000r/min离心15min，取上清液，用721型分光光度计于590 nm波长测定伊文思蓝的吸光度值A。按下式计算抑制率：抑制率（%）＝［（溶剂对照组吸光度值－药物组吸光度值）/溶剂对照组吸光度值］×100%。

1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0软件对试验数据进行处理，各配对资料间比较采用t检验，多组计量资料的多重比较采用q检验。试验数据以均数±标准差（±SD）表示。

2 结果

2.1 对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 结果见表1。与溶剂对照组相比，油樟叶乙酸乙酯萃取物中高剂量组能显著减少醋酸所致小鼠扭体的次数，呈现出一定的剂量依赖性，剂量为2.5g/kg体重时的镇痛效果与2mg/kg体重吲哚美辛相近，其镇痛百分率分别为73.95%和78.55%。

表1 油樟叶乙酸乙酯萃取物对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 （±SD）

表1 油樟叶乙酸乙酯萃取物对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 （±SD）

注：与溶剂对照组相比；＊：P＜0.05；＊＊：P ＜0.01。下表同

组别 剂量 扭体次数 镇痛百分率（%）溶剂对照组 20mL/kg 29.75±3.15 －吲哚美辛组 2mg/kg 6.38±3.96＊＊ 78.55乙酸乙酯高剂量组 2.5g/kg 7.75±5.18＊＊ 73.95乙酸乙酯中剂量组 1.25g/kg 22.13±6.06＊ 25.63乙酸乙酯低剂量 0.625g/kg 25.25±5.78 15.13

2.2 对小鼠电热板反应的影响 结果见表2。与溶剂对照组相比，油樟叶乙酸乙酯萃取物各剂量与吲哚美辛在90min以前无明显镇痛作用，120min时高剂量组开始出现显著的镇痛作用（P＜0.05），其镇痛率为40.79%。

表2 油樟叶乙酸乙酯萃取物对小鼠电热板反应的影响 （±SD）

表2 油樟叶乙酸乙酯萃取物对小鼠电热板反应的影响 （±SD）

组别 剂量镇痛率（﹪）30min 60min 90min 120min溶剂对照组 20mL/kg － － － －吲哚美辛组 2mg/kg 28.96±8.28 32.60±7.52 35.79±6.48 44.05±8.59＊＊乙酸乙酯高剂量组 2.5g/kg 21.19±5.39 29.60±7.69 10.31±4.03 40.79±13.59＊乙酸乙酯中剂量组 1.25g/kg 11.61±6.79 18.75±7.22 7.31±1.58 33.57±10.21乙酸乙酯低剂量组 0.625g/kg 9.46±4.03 16.27±4.39 5.32±2.98 3.54±2.27

2.3 对二甲苯致小鼠耳肿胀作用的影响 结果见表3。与溶剂对照组相比，乙酸乙酯萃取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀具有一定降低作用，且具有剂量依赖性，高剂量组能显著降低小鼠耳肿胀（P＜0.05），其抑制率为12.85%，其他剂量组无明显抑制作用。乙酸乙酯萃取物的抑制作用低于吲哚美辛。

表3 油樟叶乙酸乙酯萃取物对二甲苯致小鼠耳肿胀作用的影响

2.4 对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响结果见表4。与溶剂对照相比，乙酸乙酯萃取物能极显著降低小鼠腹腔透过的染料量（P＜0.01），有较强的剂量依赖性抗炎作用，高剂量组的作用略低于吲哚美辛，其抑制率分别为73.62%和77.95%。

表4 油樟叶乙酸乙酯萃取物对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响

3 分析与讨论

疼痛是伴有现存组织损伤和潜在组织损伤的一种不愉快的感觉和情绪上的主观感受，是许多疾病的伴随症状，疼痛得不到缓解不利于机体康复［6］。药物治疗是缓解疼痛的主要措施之一。小鼠扭体法（化学刺激）和小鼠热板法（物理刺激）是镇痛药物研究的常用方法。扭体法是将刺激剂注入小鼠腹腔，引起炎性介质前列腺素的释放，诱导产生疼痛，该模型常用作外周镇痛药的筛选；热板法是利用小鼠爪趾对热刺激非常敏感的特性，小鼠主要表现为跳跃、缩足、舔足，该模型常用作中枢性镇痛药镇痛作用的评价［7］。本试验结果表明，油樟叶乙酸乙酯萃取物能显著减少醋酸所致小鼠扭体次数，对热板法试验模型无显著镇痛作用，说明油樟叶乙酸乙酯萃取物具有一定的外周镇痛作用，无明显中枢镇痛作用，其具体作用机制还需进一步研究。

炎症是机体对致炎因素的局部损伤所产生的防御性应答反应，其典型特征是红、肿、热、痛和功能障碍。非特异性炎症反应存在3个时相，即急性期以局部血管扩张和毛细血管通透性增加为特征；亚急性期以白细胞和吞噬细胞浸润为特征；慢性增殖期以组织变性和纤维化为特征［3］。炎症急性期的毛细血管扩张和毛细血管通透性升高，可加速炎性渗出，使血管内液体成分和炎症细胞进入组织中引起局部肿胀［8］。二甲苯可引起耳廓急性炎症水肿，醋酸可引起小鼠腹腔毛细血管通透性增加。本试验结果表明，油樟叶乙酸乙酯萃取物高剂量组能显著抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，所有剂量组能极显著地抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管内通透性升高。可见，油樟叶乙酸乙酯萃取物能抑制毛细血管通透性升高，表现出一定的抗炎作用，但其减轻炎症急性期肿胀作用较弱。这可能是由于乙酸乙酯萃取物对于毛细血管通透性增加所致炎性渗出的抑制程度小于其他因素所致炎性渗出，从而导致中低剂量组不能显著抑制炎性组织肿胀。

研究表明，香樟（C.camphora）、土肉桂（C.osmophloeum）和台湾肉桂（C.insularimontanum）等樟属植物的提取物对PGE2、NO、TNF－α、IL－1β、IL－12和IL－6等多种炎症介质具有明显抑制作用［2，9－10］，并从土肉桂中分离出具有抗炎活性的黄酮苷类物质［9］。对于油樟叶中镇痛抗炎活性成分的分离鉴定及其抗炎机理，有待进一步研究。

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