荣昌猪C－Fos原癌基因克隆与序列分析

卢 梅，孙 波，李 建，肖 榕，李 靖，郑小波

（西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌402460）

原癌基因是细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高度保守。原癌基因是细胞的正常基因，其表达产物对细胞的生理功能极其重要，当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而导致细胞癌变形成肿瘤。原癌基因种类很多，涉及到细胞信号传递的各个层次［1］。C－Fos是一种原癌基因，属于快速早期基因。其编码的Fos蛋白是真核细胞内调控因子，在信号传导过程中起重要作用。大量研究发现，C－Fos原癌基因及其蛋白不仅参与细胞的正常生长、分化过程，而且参与细胞内信息传递过程和细胞的能量代谢过程，在生命活动中起着极为基本而重要的作用［2］。

近年来，国内外对人、野猪、鼠等动物C－Fos基因及相关研究均有报道，并通过大量试验证明，在精子发生过程中，C－Fos在生殖细胞内呈现出阶段性和特异性表达，在生精细胞发育过程中起着重要调控作用［3］。荣昌猪C－Fos的研究少，本试验对其进行了克隆与序列分析，为进一步研究荣昌猪C－Fos基因的结构和功能提供理论依据，同时也为荣昌猪其他功能基因的研究提供可靠的分子内标。

1 材料与方法

1.1 材料 本试验所需的睾丸由荣昌畜牧局养殖场提供。EASYspin Plus组织/细胞RNA试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒、DL－2 000Marker、割胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、E.coliDH5α、pMD18－T载体连接试剂盒等，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank上登录的 野 猪 C－Fos序 列 （AJ132510.1），使 用 Primer Primer5软件设计2对分段特异性引物P1、P2和P1′、P2′，这两对引物扩增的目的基因片段 C－Fos－1和C－Fos－2长度分别为827bp和718bp，引物序列如下：

① P1：5′－ATGATGTTCTCCGGCTTCAAC－3′

P2：5′－CTGGGAACAGGAAGTCATCAAA－3′

② P1′：5′－TCCGAAGGGAAAGGAATAAGAT－3′

P2′：5′－TTTTTTTCACAGGGCCAGC－3′

1.2.2 总RNA的提取 组织总RNA的抽提方法按试剂盒说明书操作。

1.2.3 cDNA的获取及RT－PCR 按反转录试剂盒说明操作，以荣昌猪睾丸总RNA为模板反转录为第一链cDNA，利用特异性引物进行PCR扩增荣昌猪的C－Fos原癌基因。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4 纯化回收、载体构建及阳性克隆筛选 按DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、pMD18－T载体连接试剂盒及其说明书操作。最后以1%琼脂糖凝胶电泳阳性鉴定。

1.2.5 序列测定及分析 将PCR检测为阳性的菌落扩大培养，保藏，并送TaKaRa公司测序，拼接。采用DNAman进行序列分析后，使用 MEGA5.03软件按NJ法构建系统进化树，Bootstrap值设为1 000。

2 结果

2.1 总RNA提取及鉴定 按照EASYspin Plus组织/细胞RNA快速提取试剂盒说明书操作提取荣昌猪睾丸组织总RNA。得到OD260/OD180为2.1，且电泳可见清晰的28s和18s条带，前者亮度约为后者两倍，说明提取的RNA比较完整且降解较少，符合用于反转录合成cDNA要求。结果如图1。

2.2 C－Fos的PCR扩增 用特异性引物以荣昌猪的总RNA为模板进行PCR扩增，在750bp上下各扩增出明显的单一条带，它与预期估计值827bp、718bp较为接近（图2）。

2.3 PCR鉴定阳性克隆 将纯化的C－Fos PCR产物与pMD18－T Vector连接，CaCl2法转化E.coliDH5α，LB/Amp固体培养基37℃培养12～14h，挑取单个菌落于LB/Amp液体培养基再培养6～7h，然后将菌液经PCR扩增鉴定阳性克隆，结果为阳性（图3）。

2.4 C－Fos碱基测序及分析 将经过PCR鉴定阳性的菌液送至TaKaRa公司进行双向测序，根据各序列的重叠区域进行拼接，得出全长为1 143bp，最终得到荣昌猪C－Fos ORF序列并上传至GenBank，获得序列号JX861095。将荣昌猪C－Fos序列与野猪（AJ132510.1），马 （XM _001491972.2），牛（AY322482.1），绵羊（NM_001166182.1），家猫（DQ288168.1），大熊猫（XM_002914704.1），人（NM_004469.4），黑猩猩（AB219119.1），猕猴（AB219121.1），大鼠（DQ089699.1），小鼠（NM_010234.2），家兔（XM_002714687.1），等 C－Fos用DNAman进行核酸同源性比对，结果显示，同源性分别为99.48%、95.20%、95.20%、94.14%、93.7%、94.14%、93.0%、93.10%、93.10%、88.58%、82.48%、88.58%。用MEGA 5.03按NJ法构建系统进化树（图4）。

3 讨论

研究发现C－Fos原癌基因表达有组织、细胞、阶段的特异性。在胚胎早期仅在胚胎外组织如羊膜和胎盘中表达。胚胎后期则出现在发育中的中枢神经系统、胚胎骨、软骨和牙齿生长区［4］。在成体器官中，C－Fos表达于巨噬细胞和粒细胞，另外还在生殖细胞中表达。但在其他大多数的细胞中，它的表达水平相对较低，需要通过刺激才能维持高表达［5，16］神经系统科学家认为，在神经元产生动作电位的时候经常表达［6］。C－Fos已经被证明与许多物质如酪蛋白激酶2［7］，α1、B细胞淋巴瘤蛋白3抗体［8］、DNA 损伤诱导转录因子 3［9］、辅因子 BRCA1［10］、TATA 结合蛋白［11］、核受体辅活化因子1，2［12］、相关转录因子1，2［13］、c－jun［14］和 SMAD3［15］等相关。目前国内外对C－Fos的研究相对较少，对猪的研究更少。GenBank上登陆的C－Fos序列来自野猪，而荣昌猪作为中国四大地方猪种之一，却缺乏此方面的研究。本试验根据GenBank上登录的野猪CFos序列，用Primer Primer5软件进行分段设计引物。扩增出特异性片段后，经双向测序，获得两段序列。根据各序列的重叠区域进行拼接，得出全长为1 143bp，编码381个氨基酸，其起始密码子为ATG终止密码子为TGA。

图4 不同种C－Fos CDS序列构建NJ法系统进化树

将荣昌猪C－Fos与野猪、马、牛等进行分析比对，发现在这些种系中的Fos蛋白序列统一性为69.40%，而且在这些种系中的Fos均存在一个由88个完全相同的氨基酸顺序组成的区域。这个区域包括一个能与DNA结合的基本区和LZ结构。荣昌猪C－Fos的CDS序列与其他动物的CDS进行同源性分析比较，结果显示，其进化关系与基因水平一致，荣昌猪与野猪的同源性最高，与其他动物则较野猪的同源性相对较低。用 MEGA 5.03软件按NJ法构建系统进化树，结果显示，C－Fos在种间、种内的距离与宽度和重叠排列上都有所不同，相同的物种聚为一枝，且自展自持率均大于90%，大熊猫、猫、兔独立成枝与荣昌猪的亲缘关系更远。

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