几种天然植物提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用

曹伟伟，朱晓娜，李明静,2*

(1.河南大学 化学化工学院，河南 开封 475004； 2.河南大学 河南省天然药物与免疫工程重点实验室，河南 开封 475004)

酪氨酸酶(TYR)又称多酚氧化酶，儿茶酚氧化酶，广泛存在于植物、动物和微生物中[1].酪氨酸酶是生物合成黑色素细胞的主要限速酶，抑制酪氨酸酶的活性，可改善皮肤色素细胞中酪氨酸酶的代谢，阻止色素沉着，达到美白效果[2]. 已应用于美白化妆品中的化学合成美白剂如氢醌则因具有较大的细胞毒性目前已较少采用. 天然植物提取物具有无毒、安全等特点，因此，天然植物类化妆品的开发研究越来越受到国内外广大消费者的青睐，同时具有很大的市场潜力. 茶多酚的主要成分是儿茶素[3]，具有清除人体自由基、祛斑、防晒等作用[4]. 金银花叶子中主要有木犀草素、木犀草苷、忍冬苷等黄酮类化合物[5], 这些黄酮类物质是一种天然的抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子自由基及抗衰老等作用，其中木犀草素还具有抗菌、抑酶等作用. 丹皮酚又称牡丹酚，研究证实[6]丹皮酚具有抗炎、抗菌、抑制皮肤色素合成、消瘀化斑等作用. 鉴于茶多酚、丹皮酚及木犀草素都具有抑制黑色素形成的特点，本文作者研究其抑制酪氨酸酶活性，为开发天然植物提取物在美白化妆品领域的应用开辟新的途径.

大多黄酮类化合物在水中较难溶解，据文献报道[7,8]常用甲醇、乙醇、DMSO等溶剂溶解黄酮类化合物，但我们通过实验发现甲醇、乙醇、DMSO对酪氨酸酶均有很强的抑制作用. 本文通过大量实验筛选出了既可以增大金银花叶子总黄酮及丹皮酚在水中的溶解度同时对酪氨酸酶活性又不产生影响的新溶剂体系，即1%丙三醇和1%吐温-80(体积比1∶1)混合溶液作为溶剂体系，并分别研究了茶多酚、丹皮酚、金银花叶子总黄酮提取物等对酪氨酸酶活性的抑制作用.

1 实验部分

1.1 材料与试剂

酪氨酸酶(965 U/mg)，3,4-二羟基苯氨酸(L-DOPA)，购于上海宝曼生物科技有限公司；茶多酚，实验室自制(从信阳毛尖中提取，纯度85%)；金银花叶子乙酸乙酯提取物，实验室自制(以芦丁做标准品测得总黄酮含量为86%)；丹皮酚，实验室自制(从牡丹皮中提取，纯度99%)；Vc，丙三醇，吐温-80，K2HPO4·3H2O，KH2PO4等试剂均为国产分析纯；二次蒸馏水.

1.2 仪器

紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，河南省豫华仪器有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 测定溶液的配制

二次蒸馏水做溶剂，配制0.010 mol/L的多巴溶液，50 U/mL的酪氨酸酶溶液.

1%的丙三醇和1%吐温-80(体积比1∶1)混合液做溶剂，分别配制质量浓度为0.25 g/L的Vc溶液、4.00 g/L的金银花叶子总黄酮提取物溶液、1.20 g/L的茶多酚溶液、1.06 g/L的丹皮酚溶液.

1.3.2 提取物对酪氨酸酶活性的抑制率计算[9,10]

按照如下公式计算Vc、茶多酚、丹皮酚、金银花叶子总黄酮提取物及复配物对酪氨酸酶活性的抑制率

式中，A1是加酪氨酸酶，不加提取液，只加多巴溶液时的吸光度；A2是加酪氨酸酶，不加提取液，不加多巴溶液时的吸光度；A3是加酪氨酸酶，加提取液，加多巴溶液时的吸光度；A4是加酪氨酸酶，加提取液，不加多巴溶液时的吸光度.

2 结果与讨论

2.1 溶剂的选择

据文献报道[7,8]，提取黄酮类、多酚类物质常用甲醇、乙醇、DMSO等做溶剂.但我们通过实验发现甲醇、乙醇、DMSO对酪氨酸酶均有很强的抑制作用.丹皮酚和金银花叶子提取物在水中溶解度较小，有文献报道[11]表面活性剂对难溶化合物具有一定的增溶作用，本实验通过加入表面活性剂显著增大了丹皮酚和金银花叶子提取物在水中的溶解度. 通过实验选择了既可以增大黄酮类化合物在水中的溶解度，同时对酪氨酸酶活性又不产生影响的溶剂体系，实验分别选取1%丙三醇、1%吐温-80、0.5%丙三醇和0.5%吐温-80(体积比1∶1)、1%丙三醇和1%吐温-80(体积比1∶1)、二次水、甲醇、乙醇、DMSO等溶剂体系.

以多巴为底物， 35 ℃恒温条件下，向10 mL比色管中加入50 U/mL 的酪氨酸酶溶液2.0 mL，3.5 mL的磷酸盐缓冲液(pH=6.5)，再加入浓度为0.010 mol/L多巴溶液2.0 mL，分别用1%丙三醇、1%吐温-80、0.5%丙三醇和0.5%吐温-80(体积比1∶1)、1%丙三醇和1%吐温-80(体积比1∶1)、二次水、甲醇、乙醇、DMSO定容，摇匀，同时开始计时，在475 nm处测定吸光度A，开始6 min每分钟测一次，以后每隔2 min测一次，至12 min.结果如图1所示.实验结果表明除甲醇、乙醇、DMSO以外的上述其他溶剂体系对酪氨酸酶活性均没有影响，并且其中 1%丙三醇和1%吐温-80(体积比1∶1)溶剂体系可显著增大丹皮酚和金银花叶子提取物在水中的溶解度，故选择1%丙三醇和1%吐温-80(体积比1∶1)混合液作为溶剂体系.

2.2 不同植物提取物对酪氨酸酶的抑制作用

2.2.1 Vc对酪氨酸酶的抑制

35 ℃恒温条件下，向10 mL比色管中加入2.0 mL酪氨酸酶溶液，3.5 mL磷酸盐缓冲液，再分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL 0.25 g/L Vc溶液，最后加入2.0 mL多巴溶液，定容，恒温2 min，在475 nm处测定吸光度，按照1.2.2的方法计算抑制率.不同浓度的Vc对酪氨酸酶活性的抑制作用如图2所示，实验结果表明随着Vc浓度的增大，对酪氨酸酶的抑制作用增强，抑制率达到50%的Vc质量浓度(IC50) 为14.51 mg/L. Vc能够显著地抑制细胞黑色素形成，也是公认的祛斑美白剂.

1. 1%丙三醇2. 1%吐温-803. 0.5%丙三醇和0.5%吐温-804. 1%丙三醇和1%吐温-805. 二次水6. 甲醇7. 乙醇8. DMSO图1 不同溶剂对酪氨酸酶活性的影响Fig.1 Different solvents on activity of tyrosinase

图2 Vc对酪氨酸酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Vc on activity of tyrosinase

2.2.2 茶多酚对酪氨酸酶的抑制

35 ℃恒温条件下，向10mL比色管中加入2.0 mL酪氨酸酶溶液，3.5 mL磷酸盐缓冲液，再分别加入0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5、1.7 mL 1.20 g/L的茶多酚溶液，最后加入2.0 mL多巴溶液，定容，恒温2 min，在475 nm处测定吸光度，按照1.2.2的方法计算抑制率.不同浓度的茶多酚对酪氨酸酶活性的抑制作用如图3所示，结果表明随着茶多酚浓度的增大，对酪氨酸酶活性的抑制作用增强，当茶多酚的质量浓度达到0.20 g/L时，对酪氨酸酶的抑制率达到62.20%. 抑制率达到50%的茶多酚质量浓度(IC50)为0.113 0 g/L.与对照品Vc相比茶多酚对酪氨酸酶具有较好的抑制效果，将成为一种新型功能性化妆品添加剂应用于美白化妆品中.

2.2.3 金银花叶子总黄酮提取物对酪氨酸酶的抑制

35 ℃恒温条件下，向10 mL比色管中加入2.0 mL酪氨酸酶溶液，3.5 mL磷酸盐缓冲液，再分别加入0.5、0.7、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 4.00 g/L金银花叶子总黄酮提取物溶液，最后加入2.0 mL多巴溶液，定容，恒温2 min，在475 nm处测定吸光度，按照1.2.2的方法计算抑制率. 不同浓度的金银花叶子总黄酮提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用如图4所示，随着总黄酮提取物浓度增大，抑制率增大，当总黄酮提取物的质量浓度达到0.6 g/L后，抑制率几乎保持不变，与对照品Vc相比金银花叶子总黄酮提取物对酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用，据文献报道[12]金银花叶子提取物既具有抑菌效果又有一定的抗羟基自由基作用，因此，将金银花叶子提取物与其他美白剂联合使用将会在美白、抗衰老化妆品领域有一定的应用前景.

2.2.4 丹皮酚对酪氨酸酶的抑制

35 ℃恒温条件下，向10 mL比色管中加入2.0 mL酪氨酸酶溶液，3.5 mL磷酸盐缓冲液，再分别加入0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5、1.7、2.0 mL 1.06 g/L丹皮酚溶液，最后加入2.0 mL多巴溶液，定容，恒温2 min，在475 nm处测定吸光度，按照1.2.2的方法计算抑制率. 不同浓度的丹皮酚对酪氨酸酶活性的抑制作用如图5所示，当丹皮酚的质量浓度达到0.14 mg/L时，抑制率达到44.50%，随着丹皮酚浓度增加抑制率几乎不变，与对照品Vc相比丹皮酚具有一定的抑制酪氨酸酶活性的作用，可考虑将丹皮酚与抑制酪氨酸酶活性较好的Vc或茶多酚复配作为化妆品添加剂，使其达到更好的美白效果.

2.2.5 茶多酚和丹皮酚复配对酪氨酸酶活性的抑制

35 ℃恒温条件下，向10 mL比色管中加入2.0 mL酪氨酸酶溶液，3.5 mL磷酸盐缓冲液，再分别加入0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、2.0、2.5、3.0、3.5 mL茶多酚和丹皮酚混合溶液(茶多酚的质量浓度为1g/L，丹皮酚的质量浓度为0.5 g/L)，最后加入2.0 mL多巴溶液，定容，恒温2 min，在475 nm处测定吸光度，按照1.2.2的方法计算抑制率. 不同浓度的茶多酚和丹皮酚复配物对酪氨酸酶活性的抑制作用如图6所示，实验结果表明茶多酚与丹皮酚复配具有较好的抑制酪氨酸酶活性的作用，可考虑将茶多酚与丹皮酚复配作为美白化妆品添加剂.

图3 茶多酚对酪氨酸酶的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of tea polyphenols on activity of tyrosinase

图4 金银花叶提取物对酪氨酸酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of extracts from honeysuckle leaves on activity of tyrosinase

图5 丹皮酚对酪氨酸酶的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of paeonol on activity of tyrosinase

图6 茶多酚和丹皮酚混合液对酪氨酸酶的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of mixture of tea polyphenols and paeonol on activity of tyrosinase

1：Vc∶丹皮酚=1∶2(质量比)；2：Vc∶丹皮酚=1∶1(质量比)图7 Vc和丹皮酚混合液对酪氨酸酶的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of mixture of Vc and paeonol on activity of tyrosinase

2.2.6 Vc和丹皮酚复配对酪氨酸酶的抑制

35 ℃恒温条件下，向10 mL比色管中加入2.0 mL酪氨酸酶溶液，3.5 mL磷酸盐缓冲液，再分别加入0.1、0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、1.7、2.0 mL Vc和丹皮酚混合溶液，最后加入2.0 mL多巴溶液，定容，恒温2 min，在475 nm处测定吸光度，按照1.2.2的方法计算抑制率.

Vc和丹皮酚按质量浓度1∶1混合(Vc的质量浓度为0.17 g/L，丹皮酚的质量浓度为0.17 g/L)，测定混合液对酪氨酸酶的抑制作用.

Vc和丹皮酚按质量浓度1∶2混合(Vc的质量浓度为0.17 g/L，丹皮酚的质量浓度为0.34 g/L)，测定混合液对酪氨酸酶的抑制作用.

实验结果表明Vc和丹皮酚按照1∶1、1∶2(质量比)复配对酪氨酸酶的活性均有较好的抑制效果，可考虑将Vc与丹皮酚复配作为美白化妆品添加剂，使其达到安全、高效的抑制黑色素形成的目的。

3 结论

本文通过大量实验筛选出了既可以显著增大黄酮类化合物在水中的溶解度又对酪氨酸酶活性不产生影响的新的溶剂体系，即1%丙三醇和1%吐温-80(体积比1∶1)溶剂体系，同时为天然黄酮类化合物抑制酪氨酸酶活性的研究提供了新的方法.

本文作者对茶多酚、丹皮酚、金银花叶子总黄酮提取物以及茶多酚与丹皮酚、Vc与丹皮酚的复配分别进行了研究，实验结果表明它们对酪氨酸酶的活性均有一定的抑制作用，并且抑制作用从强到弱依次为Vc、Vc∶丹皮酚=1∶2(质量比)、Vc∶丹皮酚=1∶1(质量比)、茶多酚、茶多酚∶丹皮酚=2∶1(质量比)、丹皮酚、金银花叶子总黄酮提取物. 这些天然植物提取物在美白化妆品领域将会有一定的应用前景.

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