发酵法生产杏鲍菇菌丝体*
2013-11-21杨海燕张雪娥吴慧珍
郭 霞，杨海燕，张雪娥，吴慧珍，张 琴
(重庆师范大学生命科学学院，重庆 401331)
杏鲍菇 (Pleurotus eryngii)学名刺芹侧耳，隶属于担子菌亚门、层菌纲、无隔担子菌亚纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属 (Pleurotus)[1]。杏鲍菇是近年来引进开发的一种优质食用菌，在全国各地均有栽培，其菌盖肥厚，菌柄粗大而中实，质地脆嫩细腻，具有杏仁香味，又有鲍鱼口感，有“草原上的美味牛肝菌”、“平菇王”的美誉。此外，杏鲍菇子实体蛋白质含量较高，脂肪和总糖含量较低，富含矿物质和维生素，具有抗癌、抑制肿瘤和美容的功效，在食品及医药领域具有广阔的开发及应用前景[2，3]。
目前，由液体发酵法生产菌丝体及胞外产物的方法，具有发酵周期短、容易操作、不受季节限制等优点，越来越受到研究者的关注。研究适宜杏鲍菇菌丝生长的培养基，不仅可以为工业化生产菌丝及胞内产品开发提供理论依据，还有利于人工栽培缩短菌丝生长时间，从而提高生产效率。因此，探索一种有利于杏鲍菇菌丝体生长的培养基非常必要。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
供试杏鲍菇菌株由组织分离获得，子实体购于重庆盘溪市场，由重庆师范大学生命科学学院微生物研究所研究人员鉴定保存。
1.2 种子液的制备
种子培养基:马铃薯 200.0 g·L－1、葡萄糖 11.0 g·L－1、蛋白胨 2.0 g·L－1、KH2PO43.0 g·L－1、MgSO41.0 g·L－1、VB10.01 g·L－1，水1 000.0 mL。从活化的 PDA培养菌种上取3块0.5 cm2的菌块，接入摇瓶中，温度 (27±0.5)℃，180 r·min－1培养 168 h，制得液体种子液[4]。
1.3 测定方法
1.3.1 菌丝生物量的测定
将发酵液真空抽滤，用蒸馏水清洗干净后，收集菌丝体，(60±0.5)℃下烘干至恒重，电子天平称重。
1.3.2 油的测量
取5.0 mL发酵液，按照1∶2的体积加入乙醚，添加到分液漏斗中震荡，分层后去掉下层，上清液放入称量杯中，(60±0.5)℃烘干称重。
1.4 碳源对菌丝生长的影响
1.4.1 糖种类筛选
基础培养基:葡萄糖 20.0 g·L－1、蛋白胨 5.0 g·L－1、MgSO41.0 g·L－1、KH2PO40.5 g·L－1、VB10.01 g·L－1，水1 000.0 mL，pH 6.0。
分别用蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘油、乳糖代替基础培养基中的葡萄糖，以基础培养基做对照，每个配方做3个重复。接种量5.0%，每250 mL装液100 mL，培养温度(27 ±0.5)℃、转速180 r·min－1，震荡培养168 h。
1.4.2 植物油筛选
在基础培养基中分别添加10.0 g·L－1芝麻油、花椒油、葱油、大豆油、辣椒油、菜籽油、瓜子油[5]，培养方法同1.4.1。
1.5 氮源对菌丝生长的影响
分别用硫酸铵、硝酸钾、酵母膏、牛肉膏、麦麸代替基础培养基中的氮源蛋白胨，以基础培养基做对照，培养方法同1.4.1。
1.6 正交实验
在单因素试验的基础上，选取可溶性淀粉、牛肉膏、葱油做三因素三水平的正交设计，共9个组合 (表1)。
1.7 发酵过程分析
利用摇瓶实验比较了正交实验优化后和优化前发酵液在0～168 h的生物量、pH和残油量变化，每个样品3个重复，试验因子水平表见表1。
表1 正交试验因子水平表L9(34)
2 结果与分析
2.1 碳源对菌丝生长的影响
2.1.1 碳源对菌丝生长的影响
碳源对菌丝生物量的影响见表2。
表2 碳源对菌丝生物量的影响
由表2可见杏鲍菇对可溶性淀粉利用较好，菌丝干重达到(18.516±1.959)g·L－1，其次是葡萄糖，菌丝干重达到(12.812±0.231)g·L－1。蔗糖、麦芽糖、甘油、乳糖分别为碳源时，菌丝干重分别达到 (11.732±0.72)g·L－1、(11.315±0.603)g·L－1、(11.211 ±0.217)g·L－1、(9.016 ±0.048)g·L－1。通过单因素方差分析，杏鲍菇菌丝体以可溶淀粉为碳源时，能显著提高菌丝产量 (p＜0.05)。以乳糖为碳源时，生物量显著降低。因此，选择可溶性淀粉进行下一步试验。
2.1.2 植物油对菌丝生长的影响
通过单因素方差分析，结果见表3。
表3 不同植物油对菌丝生物量的影响
从表3可知植物油能显著提高菌丝产量 (p＜0.05)。其中，添加葱油后菌丝生物量最大，达 (35.467±0.091)g·L－1，其次是辣椒油、瓜子油、大豆油、花椒油、芝麻油、菜籽油。
2.2 氮源对菌丝生长的影响
氮源对菌丝生物量的影响见表4。
表4 不同氮源对菌丝生物量的影响
由表4可知，有机氮源更适宜菌丝生长，牛肉膏为氮源时可获得最大生物量 (19.056±0.241)g·L－1，生物量显著提高 (p＜0.05)，其次是蛋白胨和酵母膏。硫酸铵或硝酸铵为唯一氮源时，菌丝产量显著下降。
2.4 正交实验优化结果
正交试验优化结果、方差分析结果见表5、表6。
表5 正交试验优化结果
表6 方差分析
通过正交试验的极差分析及方差分析，表5中极差R为同一因素中各水平的实验指标总和的最大与最小值之差，其大小表示各因素水平的变化对实验指标的影响。各因素的影响依次为葱油＞牛肉膏＞可溶性淀粉，与表6中方差分析结果一致。方差分析结果显示，葱油和牛肉膏浓度对生物量具有显著影响 (p＜0.05)，可溶性淀粉浓度对生物量的影响未达到显著水平。因此，从节约成本出发，最优组合为A1B3C3即7 号培养基，淀粉 10.0 g·L－1、牛肉膏 10.0 g·L－1、葱油15.0 mL·L－1，可获得最大生物量 35.672 g·L－1。
2.5 发酵过程分析
杏鲍菇菌丝发酵过程分析见图1。
通过图1发酵过程曲线分析，优化前生物量明显比优化后生物量低，可见培养基优化后生物量明显提高。在0～96 h葱油迅速被菌丝利用完，在120 h菌丝生物量达到最大(35.810±3.232)g·L－1，而对照在 168 h才达到最大生物量 (17.223±0.401)g·L－1。优化后的发酵液pH从24 h～120 h迅速降低，120 h时pH降到最低5.0，120 h后逐渐升高，而对照组在0～168 h呈现逐渐下降的趋势，说明优化后的培养基中菌丝代谢更旺盛，产生了大量酸性物质，导致pH降低。
3 讨论
单因素试验结果表明，不同营养物质对菌丝生长有显著影响。蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘油、乳糖、葡萄糖分别为碳源时，可溶性淀粉为最适碳源;植物油能显著促进菌丝生长，在辣椒油、瓜子油、大豆油、葱油、花椒油、芝麻油、菜籽油中，添加10.0 g·L－1葱油后，菌丝生物量最大。Wardle[6]等也发现将类脂加到香菇的基础培养基中，促进了蘑菇菌丝体生长。赵明亮[7]等通过香菇液体发酵，发现油能促进香菇菌丝生长。Yang[8]等在灰树花深层培养中，发现每100毫升0.15 g油酸能促进菌丝生长，棕榈酸也能促进多糖合成，但是每100毫升0.1 g亚油酸能显著抑制菌丝和多糖的合成。邹祥等[5]在药用真菌桑黄的液体发酵中也发现菜籽油能提高桑黄菌丝的生物量，但是对胞外多糖具有显著抑制作用，其机理可能是植物油促进了细胞膜的通透性，有利于菌丝对培养基营养成分的吸收，从而促进菌丝生长。有机氮源比无机氮源更有利于杏鲍菇菌丝生长，硫酸铵、硝酸钾、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨中，牛肉膏为最适氮源。
在单因素试验的基础上，通过正交试验优化菌丝生长培养基，最优组合为淀粉 10.0 g·L－1、牛肉膏 10.0 g·L－1、葱油 150.0 g·L－1，菌体生物量可达 35.672 g·L－1。其中，葱油和牛肉膏浓度是提高产量的重要因素。根据发酵过程分析，优化后的培养基能显著促进菌丝生长代谢，提高了菌丝生物量，说明优化后的培养基确实更适合菌丝生长。
虽然对杏鲍菇工业化人工栽培的报道较多，但是通过液体培养获得大量菌丝体的报道较少，尤其是在添加植物油能显著提高生物量、缩短菌丝生长时间方面还未见文献报道。在优化的培养基下菌丝生物量明显增加，其菌丝形态结构、胞内菌丝多糖含量及结构变化等研究工作正在进行中，希望能对杏鲍菇人工栽培，提高菌丝及胞内产物产量提供理论参考。
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[3]潘崇环，孙萍.珍稀食用菌栽培与名贵野生菌的开发利用 [M].北京:中国农业出版社，2004.
[4]何莉莉，韩成玲，范文丽，等.矿质元素对北虫草继代培养不同菌落子实体产量及菌丝生长速度的影响[J].微生物学通报，2010，37(9):1331－1340.
[5]邹祥，郭霞，孙敏.前体对桑黄菌丝生长和胞外多糖合成的影响[J].食品科学，2010，31(21):262－265.
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[7]赵明亮，邓世瑜.油与香菇菌丝生长的关系 [J].食用菌，1987(26):19－20.
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