镰形棘豆总黄酮对TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞增殖的研究*

王晓红，杨晓云，李 钦，杨丽霞，李晓东，姜 华

(1．嘉峪关市第一人民医院，甘肃 嘉峪关735100; 2．甘肃省中医学校，甘肃 兰州730050;3．甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州730050)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最为常见的慢性微血管并发症之一，严重威胁着糖尿病患者的生命。在美、日和欧洲等发达国家和地区，DN 已成为终末期肾脏疾病的首位病因(约占35%)和糖尿病患者死亡的主要原因，在我国DN 发病率也呈逐年上升趋势［1］。目前，DN 的发病机制尚未明确。既往认为DN 的早期病变部位在肾小球，近年来研究发现肾小管病变及肾间质纤维化的程度与肾功能的相关性更为密切，故肾间质纤维化的机制在DN 的发展中越来越受到人们的重视［1］。细胞增殖是组织器官发生纤维化的病理改变之一，一般发生在纤维化形成初期，因此，为了早期预防纤维化的发展，抑制细胞增殖显得至关重要。镰形棘豆总黄酮是甘肃省中医药研究院中药研究所提取分离的镰形棘豆的有效组分。前期研究［2－3］表明:镰形棘豆药材氯仿提取物、总黄酮苷元及主要黄酮化合物具有较强的抑菌、抗炎、抗氧化的作用。目前大量研究表明:植物黄酮类化合物在治疗糖尿病及其并发症方面具有显著疗效［4－6］，荞麦花叶总黄酮、玉米须总黄酮、葛根黄酮等黄酮苷药物具有降血糖、改善胰岛素抵抗的的功效，有些已应用于临床［7－9］。为了进一步探讨镰形棘豆总黄酮的药理作用，本课题研究了镰形棘豆总黄酮干预转化生长因子－β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细(HK-2)胞增殖情况，为其防治DN 肾纤维化的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 动 物

SPF 级Wistar 大鼠24 只，雄性，体质量(200 ±20)g，购于甘肃中医学院动物中心，许可证号:SCXK(甘)2004-0006。普通饲料喂养，饲养于兰州军区总医院屏障级动物实验室，许可证号:SYXK-(军)2007-022。

1．2 细胞株

HK-2 购自兰州大学实验中心。

1．3 药品、试剂与仪器

镰形棘豆总黄酮，由甘肃省中医药研究院中药研究所提供。DMEM/F12(1∶1)细胞培养基，购自Gibco 公司;胎牛血清，购自Hyclon 公司;MTT、EDTA、胰蛋白酶、DMSO，均购自Amresco 公司;人重组TGF-β1，R＆D System，产地美国，根据说明书，用含1 g /L 牛血清白蛋白的无菌弱HCl(4 mM)配制为1 ng/L 的储存液，无菌EP 管－70 ℃储存，用时配成10 pg/L 浓度［10］。HEAL CELL HL90 二氧化碳培养箱，香港力康生物医疗科技控股有限公司产品;BSC－1000IIA2 生物洁净安全柜，苏州安泰空气技术有限公司产品;Olympus X－71 倒置显微镜，产地日本;CliniBio 128L－400 酶标仪，产地奥地利。

1．4 镰形棘豆总黄酮药物血清制备

将24 只大随机分为空白组、药物组(镰形棘豆总黄酮)2 组，每组12 只。适应性喂养1 周后，药物组按300 μg/g 给大鼠灌胃，空白组灌服同体积生理盐水，每次10 μL/g 体质量，2 次/d，连续灌胃3 d。于末次灌胃前8 h 禁食不禁水;末次灌胃30 min 后，大鼠股动脉无菌采血;静置2 h，3000 r/min 冷冻离心20 min，取上清;将同组血清混合，56 ℃水浴灭活30 min，－20 ℃低温保存备用。

1．5 细胞培养与实验分组

HK-2 细胞用含体积分数10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 链 霉素DMEM/F12(1∶1)完全培养基，于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养。每隔2～3 d 换新鲜培养基1 次，培养融合至80 % 以上，用含2．5 g/L 胰蛋白酶、0．5 g/L EDTA 的消化液消化，用完全培养基终止消化后，1000 r/min 离心5 min。用新鲜培养基将细胞重悬后进行传代培养。实验前先用无血清培养基培养24 h 使细胞同步化，实验重复3 次。传代培养的HK-2 细胞分为以下4 组:①空白对照组:DMEM/F12 培养液。②单纯TGF-β 诱导组:DMEM/F12 培养液+ 10 μg/L TGF-β1。③空白血清对照组:DMEM/F12 培养液+10 μg/L TGF-β1+ 体积分数10%空白血清。④干预组:DMEM/F12 培养液+10 μg/L TGF-β1+体积分数10%镰形棘豆总黄酮药物血清。

1．6 检测指标

1．6．1 细胞形态观察

细胞以1．5 ×105个/mL 密度接种于6 孔板，每孔2 mL，每组2 个复孔。在37 ℃、体积分数5%CO2孵箱培养过夜。吸弃细胞上清，加入无血清培养基2 mL 静止24 h，使其同步化。弃细胞上清，按分组加入相应药品2 mL，对照组加入培养基2 mL。孵育24 h，倒置显微镜下观察细胞形态，并拍照。

1．6．2 MTT 法检测细胞增殖

细胞以3 ×104个/mL 密度接种于96 孔板，每孔100 μL，每组5 个复孔。在37 ℃、体积分数5%CO2孵箱培养过夜。吸弃细胞上清，加入无血清培养基100 μL 静止24 h，使其同步化。弃细胞上清，按分组加入相应药品100 μL，对照组加入培养基100 μL，分别在24，48，72 h 时各取出1 板，弃培养上清液，加入1 g/L MTT 100 μL 孵育4 h。弃上清，加入DMSO 100 μL，左上角孔中加入100 μL DMSO作为“调0 孔”，振荡10 min 使蓝紫色结晶完全溶解，在酶标仪上492 nm 处测定吸光A 值。

1．7 统计学方法

采用SPSS 13．0 统计分析软件处理。数据以均数()±标准差(s)表示，进行单因素方差分析(Oneway ANOVA)。以P＜0．05 为差别有统计学意义。

2 结 果

2．1 镰形棘豆总黄酮对HK-2 细胞形态的影响

倒置显微镜下观察显示:正常状态下，HK-2 呈铺路石样贴壁生长。经10 μg/L TGF-β1诱导后，细胞变长呈梭形，细胞间隙变大，细胞整体呈现纤维样生长，但与镰形棘豆总黄酮药物血清共同干预后，细胞的纤维样状态变化不明显，而空白血清无此作用。见图1。

图1 镰形棘豆总黄酮对HK-2 细胞形态的影响

2．2 镰形棘豆总黄酮对HK-2 细胞增殖的影响

MTT 法检测结果显示:HK-2 细胞经TGF-β1诱导后增殖明显，与空白对照组对比，差别有统计学意义(P＜0．05)，且细胞增殖具有显著的时间依赖性;但经过与镰形棘豆总黄酮药物血清共同干预，细胞增殖在一定程度上受到抑制，与单纯TGF-β1诱导组对比，差别有统计学意义(P＜0．05)，而空白血清无此作用。见表1。

表1 不同时间点各组HK-2 细胞增殖情况对比吸光值A492 nm，n=6，±s

表1 不同时间点各组HK-2 细胞增殖情况对比吸光值A492 nm，n=6，±s

注:与空白对照组对比，* P ＜0．05;与单纯TGF-β1 诱导组对比，# P ＜0．05。

A 24h A 48h A 72h空白对照组 0．247±0．004# 0．291±0．004# 0．311±0．003组 别#单纯TGF-β1 诱导组 0．287±0．005* 0．343±0．009* 0．362±0．006*空白血清对照组 0．287±0．005* 0．346±0．008* 0．358±0．005*干预组 0．263±0．004# 0．315±0．003# 0．332±0．015#

3 讨 论

DN 时肾小管病变可发生在肾小球病变之前、之后或同时发生。病变初期表现为肾小管基底膜增厚、小管数目增加及小管肥大，后期发生肾小管萎缩及间质纤维化。肾间质纤维化是所有慢性肾脏疾病进行性发展的重要病理基础［11］。多年研究证明:TGF-β 超表达是肾纤维化形成的关键因子。TGF-β超表达能促进细胞增殖，而细胞增殖是组织器官发生纤维化的病理改变之一，一般发生在纤维化形成初期，是细胞外基质(ECM)产生的主要来源，而ECM 过度沉积是纤维化病变的主要特征［12］。目前，许多研究已将TGF-β 作为研究肾小管上皮细胞向成纤维细胞转分化的经典诱导因子。

现代医学针对肾间质纤维化的防治措施主要有使用血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂、TGF-β1中和抗体或天然拮抗剂、基因治疗等诸多方面，但其抗肾纤维化效果并不理想。近年来，中医药从扶正固本、活血化瘀、清热利湿、化浊排毒等多个角度，从单味中药、中药有效成分及中药复方制剂多个方面进行抗纤维化的实验及临床研究，取得了一定的进展［13－14］。

本实验研究发现:镰形棘豆总黄酮在一定程度上具有抑制TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞增殖的作用。显微镜下观察显示:镰形棘豆总黄酮能预防TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞的纤维样改变，在一定程度上维持了细胞形态的稳定性。MTT 检测显示:镰形棘豆总黄酮能够抑制TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞增殖，在一定程度上预防了早期纤维化的形成。

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