河南汉族肺结核患者PTPN22基因多态性检测

肖 海，杨洪毅，张照婧，张言鹏，李晓文#

1)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院生殖医学中心 郑州 4500523)郑州大学临床医学系 郑州 450052

蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22，PTPN22)基因编码淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸磷酸酶(lymphoid tyrosine phosphatase, LYP)，在T细胞活化的信号传导中起着重要的负调节作用[1]。作者应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测PTPN22基因rs33996649和rs2488457位点的多态性进，探讨二者与河南汉族人群肺结核(pulmonary tuberculosis，TB)形成之间的关系，以期为TB的发病机制及治疗诊断提供数据和参考。

1 对象与方法

1.1研究对象病例组：214例初诊TB患者来自2010年至2012年河南安阳、新乡、新密等地传染病医院的住院患者，其中男128例，女86例，年龄20～56(38.9±17.6)岁，TB的诊断符合中华人民共和国卫生部通告[2008]2号文件的WS 288-2008 肺结核诊断标准，排除糖尿病、HIV感染、使用肾上腺皮质激素及其他免疫抑制剂者。正常对照205例，其中男141例，女性64例，年龄20～52(36.0±15.7)岁，为同期体检的健康个体。以上研究对象之间无血缘关系，并均得到本人或监护人知情同意。

1.2PTPN22基因rs33996649与rs2488457位点的多态性检测采用PCR-RFLP法。抽取研究对象的静脉血3 mL，EDTA抗凝，酚/氯仿法提取基因组DNA。引物序列均来源于GeneBank，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。PCR反应体系：样本DNA 2 μL，Mix(含染料)10 μL，上、下游引物各1 μL，补充去离子水至20 μL。扩增条件：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 25 s，72℃ 30 s，循环30次；72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。取PCR扩增产物10 μL，加相应的限制性内切酶5 U，10×缓冲液2 μL，加去离子水补充体系到20 μL。rs33996649用MspⅠ消化，37 ℃水浴2 h，20 g/L琼脂糖凝胶电泳40 min；rs2488457用SacⅠ消化，37 ℃水浴3 h，35 g/L琼脂糖凝胶电泳60 min。凝胶成像分析仪上观察并分析结果，照相保存。

表1 rs33996649和rs2488457扩增引物及片段大小

1.3基因型判读rs33996649位点扩增片段大小234 bp，经MspⅠ消化后有3种基因型：C/C(143，91 bp)，G/G(234 bp)，G/C(234，143，91 bp)。rs2488457位点扩增片段大小为203 bp，经内切酶SacⅠ消化后基因型：C/C(181，22 bp)，G/G(203 bp)，G/C(203，181，22 bp)。

1.4统计学处理采用SPSS 16.0处理数据。对2组PTPN22基因两位点的基因型分布行Hardy-Weinberg平衡检验。采用χ2检验比较2组间基因型频率和等位基因频率的差异，并计算比值比(OR)及95%可信区间(CI)[2]。检验水准α=0.05。

2 结果

205 例正常人 和214例TB患者中rs33996649位点全部为C/C基因型，电泳结果见图1。随机抽取3例样本进行测序，结果与电泳结果一致。

图1 rs33996649PCR-RT-LP产物电泳图

rs2488457位点检测到2种基因和3种基因型(图2)，对照组基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=3.501，P=0.061)。病例组和对照组等位基因频率及基因型频率分布组间见表2。

图2 rs2488457 PCR-RFLP 产物电泳图

1～4、7～10、14：G/C基因型；5、11～13：C/C基因型；6：G/G基因型;M:Marker。

表2 2组rs2488457位点基因型频率和基因频率的比较 例(%)

3 讨论

TB是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，是单一病原体致死人数最多的疾病，给人类的生命和健康构成了极大的威胁[3]，其发病是复杂的多因素综合作用的结果，影响因素不仅包括感染结核杆菌、环境因素，还涉及宿主的遗传易感性。基因多态性位点可引起蛋白结构和功能上的改变，导致结核分枝杆菌感染者的不同转归，即不同个体对TB表现出不同的易感性。

PTPs是细胞信号转导中的重要调节因子,参与多种细胞功能的调控[4]。PTPN22定位于1p13.2，编码的LYP 通过C端富含脯氨酸的基序与蛋白酪氨酸激酶连接从而抑制T细胞活化[5]。一旦PTPN22基因发生变异，LYP的功能或表达量会发生改变，从而引起T细胞信号引导障碍，导致自身免疫性疾病的发生[6]。

rs2488457位于PTPN22启动子序列，该位点变异直接影响LYP的编码。Taniyama等[7]称在日本人群、朝鲜族人群和高加索人群中rs2488457位点的多态性和Ⅰ型糖尿病易感性有关。Huang等[8]对广东人群的研究发现,rs2488457位点多态性与类风湿性关节炎易感性有关。该研究显示河南汉族人群中TB患者中rs2488457的G/G基因型频率高于正常人，提示rs2488457的G/G基因型与河南汉族人群TB的发生有一定的关系。

rs33996649 位于第10外显子LYP 的催化结构域，该位点变异促使编码的多肽链的263位氨基酸残基由精氨酸转变成谷氨酰胺。 在单细胞水平上，Q263 对 TCR 信号通路蛋白去磷酸化的作用效率比野生型 R263 低，表明 Q263 是一种丧失功能型的变异，而且 LYP 的这种催化效率降低主要是由于催化结构域的改变导致[9]。Lamsyah等[10]研究发现rs33996649与摩洛哥人群的TB易感性有关，并且有报告[11]称该位点与北美人群、西班牙人群、挪威人群的自身免疫性疾病有关，但Huang等[8]发现该位点在广东人群中没有多态性，作者在河南汉族人群中也未发现该位点多态性，表明其多态性存在种族差异。PTPN22基因编码的LYP蛋白在免疫细胞中的重要调节作用，因此有必要在中国人群中进一步寻找新的单核苷酸多态性位点并探讨其与TB的相关性。

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