五指山小型猪急性心肌梗死合并急性心力衰竭模型的建立及评价

顾晓龙 黄 军 董正华 雷辉燕 龚志华 文艳飞 向定成

(南方医科大学研究生学院，广东 广州 510515)

急性心肌梗死已成为充血性心力衰竭的主要原因〔1〕，而一旦出现心力衰竭会使患者短期和长期死亡率均明显增加，因心衰再次住院次数也明显增多〔2〕。动物实验研究急性心肌梗死合并急性心力衰竭的病理生理过程，对于指导临床诊断及治疗具有重要的意义。成功复制相似的动物模型是进行相关实验的基础。小型猪因其在冠脉方面与人类存在高度相似性，一直是人类心血管疾病模型制备研究的优选动物。本研究使用介入封堵法建立五指山小型猪急性心肌梗死合并急性心力衰竭模型，并通过超声心动图及血流动力学进行心功能评估。

1 材料与方法

1.1 动物 健康五指山小型猪16头(质量合格证号:0087537，批号:4407700010)，(9±2.3)月龄，雌雄不限，体重(24±5.6)kg，由广州军区总医院动物实验中心提供。实验前小型猪均在动物实验中心隔离检1 w。所有动物饲养及实验过程均按照动物实验的3R原则进行。

1.2 方法

1.2.1 术前准备与麻醉 所有小型猪均禁食8 h以上，肌肉注射氯胺酮200 mg，速眠新0.5 ml，咪达唑仑5 mg诱导麻醉后，清洗皮肤并行胸部及双腹股沟备皮，称重后运至心内科导管室，将猪仰卧固定于手术台，头偏向一侧，牙垫固定，持续低流量吸氧。经耳后静脉建立静脉通路给以5%葡萄糖+10%氯化钾维持静滴，胸部及四肢接电极，分别记录术前及术中心电图，同时连接心电监护监测心率及心律，除颤仪接电极同步复律备用。维持麻醉给以氯胺酮50 mg+咪达唑仑5 mg，5 ml/h持续泵入，根据肢体活动及眼球转动情况对麻醉药物剂量进行调整，术前0.5 h开始静脉滴注青霉素480万单位+0.9%氯化钠100 ml。

1.2.2 股动静脉切开穿刺 10%利多卡因于腹股沟处作局部麻醉，然后沿血管走行方向切开皮肤4～5 cm，用蚊式止血钳分离组织，顺血管走行方向钝性分离筋膜和肌肉，显露股动静脉和股神经，然后分离股动、静脉间的结缔组织，清楚地暴露股动脉及股静脉。在其下方各穿2根1号线备用。提拉近心段结扎线，将穿刺针斜面向下，与水平面呈60°角刺向血管壁，可回抽出血液后，立即将注射器角度放平，并保持原位不动，送入导丝，固定导丝后退出穿刺针，沿着导丝送入6 F带扩张器的鞘管(股静脉送入7 F鞘管)，固定鞘管拔出扩张器及导丝，以肝素盐水冲管，静注肝素5 000 U，后每隔1 h追加1 000 U。

1.2.3 模型制备 在大型DSA(SIEMENS Artis)机下，通过导丝的引导送入6FJR3.5指引导管到左冠开口，行左冠状动脉造影，送入0.014×185 cm Runthrough指引导丝到左前降支(LAD)远端，根据LAD近中段内径选择相应球囊，均选择2.5×20 mm Sprinter球囊定位于前降支近段(第一对角支开口处)，3～4 atm扩张球囊，重复造影确认冠脉血流完全中断，开始行缺血预适应，先后阻断前向血流1、2、5 min，间隔1 min/次，根据该时间段是否引起频发室早、室速或室颤，决定每个阻断时间重复次数，心律稳定后持续阻断前向血流180 min。180 min后撤出球囊、导丝。

1.2.4 术后处理 手术结束后结扎血管逐层缝合，缝合前生理盐水冲洗伤口，挤出伤口内的液体及积血，缝合皮肤后对皮，酒精消毒，庆大霉素4万单位伤口外用，两组均送回动物实验室，给予青霉素480万单位2次/d肌肉注射，共3 d。

1.2.5 有创血流动力学参数测定 在进入指引导管即刻至手术结束，连续监测动脉压力变化。α漂浮导管血流动力学监测:经股静脉插入7 F五腔温敏球囊漂浮导管至肺动脉分支。在球囊封堵前，封堵后10、20、30、60 min，分别以漂浮导管测量中心静脉压(CVP)、肺动脉收缩压(PASP)及肺毛细血管楔嵌压(PCWP)，应用热稀释法测量心输出量(CO)。以制模后PASP≥18 mmHg和心输出量较制模前下降30%以上为达到动物模型标准。

1.2.6 超声心动图监测 分别于制模前、后0.5、1、2、3 h行心脏超声检查，测定左室射血分数(LVEF)及左室舒张末径(LVSDd)，同时观察室壁运动情况。

1.2.7 病理检查 术后24 h静脉注射10%氯化钾20 ml将猪处死，取出心脏，于左室前壁梗死区中心分别切取5 mm×3 mm的组织4块，置入4%的甲醛固定液中固定24 h后，制备4 μm厚度石蜡切片，并行伊红(HE)染色。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以s表示，自身前后比较采用配对t检验。

2 结果

2.1 一般情况 所有小型猪共有13头存活，存活率81.25%，其中12头达到预期的心衰模型，模型成功率75.00%。1头因股动脉出血致出血性休克死亡，1头因球囊封堵后出现顽固性室颤而死亡，1头术后24 h猝死，1头虽心梗模型制作成功但一直达到心衰标准。所有小型猪手术过程中均出现不同程度的室性心律失常，均无感染发生。

2.2 心电图改变 当球囊将LAD封堵至血流TIMI 0级，即刻可见胸前导联及T波高耸，1 min后出现ST段弓背或水平状抬高，部分小型猪可累及下壁及侧壁导联。

2.3 血流动力学变化 球囊封堵后10、20、30、60 min与球囊封堵前相比，HR、PAP、PCWP均显著上升(P ＜0.05)，30 min与60 min相比无统计学差异，30 min比20 min及10 min均显著上升，而BP、CO显著降低(P＜0.05)，30 min与60 min相比无统计学差异，30 min比20 min及10 min均显著上升，CVP仅在30 min及60 min时与封堵前相比显著上升(P＜0.05)。见表1。

表1 封堵前后血流动力学指标变化( s，n=12)

表1 封堵前后血流动力学指标变化( s，n=12)

与术前比较:1)P＜0.05，下表同

时间 HR(次/min)BP(mmHg)CVP(mmHg)PAP(mmHg)PCWP(mmHg)CO(L/min)5.80 11.00±1.41 3.56±1.33术后10 min 91.50±9.851) 98.25±14.321) 14.25±2.06 30.75±4.431) 16.75±3.181) 2.71±0.941)术后20 min 101.50±11.971) 95.75±13.801) 16.00±2.94 31.75±5.911) 22.00±4.361) 2.39±0.991)术后30 min 106.75±11.031) 93.5±9.041) 17.00±0.821) 34.25±6.931) 24.50±5.741) 2.17±0.861)术后60 min 105.50±18.481) 97.75±10.921) 16.25±2.501) 33.00±5.891) 23.75±5.121) 2.19±0.501)术前 84.00±16.69 119.00±10.89 15.00±1.41 25.75±

2.4 超声心动图检查 球囊封堵前及封堵后10、20、30、60 min行心脏彩超检查，LVEF值10 min与封堵前相比无统计学差异，20、30及60 min与封堵前相比显著下降(P＜0.05)，观察时间内均可见前壁、室间隔(或)合并下壁活动异常，60 min内LVSDd与封堵前比未见扩大，所有小型猪均未出现室壁瘤。见表2。

表2 封堵前后心脏彩超指标变化( s，n=12)

表2 封堵前后心脏彩超指标变化( s，n=12)

时间 LVEF(%)LVEDd(mm)66.25±6.24 32.08±1.64术后10 min 65.54±7.59 32.65±2.83术后20 min 58.00±4.421) 32.96±2.54术后30 min 55.50±2.651) 33.33±2.50术后60 min 52.00±5.831)术前32.15±2.18

2.5 病理检查 24 h病理大体标本显示左室下壁前部、心尖部、左室前壁和前间隔部颜色变白，未见变薄。HE染色显示梗死区域心肌出现灶性凝固性坏死，间质水肿，炎症细胞浸润。

3 讨论

急性心肌梗死是由于冠状动脉急性闭塞，导致血流中断，心肌细胞发生损伤或坏死，心肌梗死面积较大时可导致大量心肌细胞丧失收缩功能，从而使左室收缩功能下降导致急性心功能不全的发生。急性心肌梗死伴急性心力衰竭短期以及长期死亡率均较高〔3～5〕。建立良好的动物模型是进行实验研究的重要步骤。

建立模型的方法分为两类，一类是外科手术法，即开胸结扎冠状动脉〔6，7〕，但该方法创伤大，且可导致动物出入量失衡影响心力衰竭的研究，因创伤大，死亡率较高。另一类是介入法。近年来随着冠脉介入治疗的普及，废弃导管、导丝和球囊等使介入法制作心血管模型成为可能〔8，9〕。小型猪与小鼠、兔等相比体型较大，操作方便，抵抗力及耐受性好，且其冠脉分支及走行等方面与人很相似，尤其是冠状动脉的侧支循环分布都较少，不易建立侧支循环〔10〕。因此，小型猪常被用做急性心肌梗死的实验研究。

国内有学者在小型猪用球囊封堵120 min结合微血栓微球混悬液灌注方法建立急性心肌梗死伴心力衰竭模型〔11〕，该方法急性心肌梗死范围小且主要目的为建立慢性心衰模型，而非急性心力衰竭模型。本研究旨在建立急性心肌梗死伴急性心力衰竭模型，从而为研究其机制及用药提供帮助。本研究中超声心动图所观察到的射血分数下降程度不及CO下降程度，考虑可能原因为心功能下降在超声表现会适当滞后。

本研究制摸过程中有三大难点:(1)股动脉穿刺困难，因猪股动脉相对细小，皮肤组织较厚，所以盲穿成功率低，故选择切开暴露后穿刺，但切开暴露后因血管失去组织牵拉，穿刺针容易进入夹层或穿破血管，解决方法选择尽量锋利穿刺针，开始穿刺时进针角度尽量大。(2)在封堵冠状动脉后除1头外所有的小型猪均出现室速或室颤，考虑原因:与小型猪侧支循环少对缺血敏感有关;与冠状动脉封堵位置较高导致心肌缺血面积较大有关，这无疑大大增加死亡率的发生，解决方法首要的是做好缺血预适应，可适当延长缺血预适应时间，其次是抢救措施需得力，本研究团队均为有临床经验的医师参与进行，对于病情的预测判断及采取措施、使用药物均按临床规范使用，所以抢救成功率较高，围术期并发症相对低，死亡的发生主要出现在实验初期摸索阶段。(3)本研究封堵前降支位置为第一对角支处，该位置高于以往大部分心梗模型，既往的封堵位置多数在第二对角支甚至更远，这导致实验动物的风险大大增加，心律失常、心源性休克的发生增多，经过积极的抢救，并未造成过多的动物死亡，这也正是本研究的特色，只有缺血范围广泛才可能造成急性心肌梗死模型。

1 Gheorghiade M，Bonow RO.Chronic heart failure in the United States:a manifestation of coronary artery disease〔J〕.Circulation，1998;97:282-9.

2 Velazquez EJ，Francis CG，Armstrong PW，et al.for the VALIANT registry.An international prospective on heart failure and left ventricular dysfunction complicating myocardial infarction:the VALIANT registry〔J〕.Eur Heart J，2004;25:1911-9.

3 Peel AAF，Semple T，Wang I，et al.A coronary prognostic index for grading the severity of infarction〔J〕.Br Heart J，1962;24:745-60.

4 Killip T，Kimball J.Treatment of myocardial infarction in a coronary care unit:a two-year experience with 250 patients〔J〕.Am J Cardiol，1967;20:457-64.

5 Norris RM，Brandt PW，Caughey DE，et al.A new coronary prognostic index〔J〕.Lancet，1969;1:274-78.

6 Hasenfuss G.Animal model of human cardiovascular disease，heart failure and hypertrophy〔J〕.Cardiovasc Res，1998;39:60-76.

7 黄浙勇，葛均波，张少衡，等.猪急性心肌梗死模型发生心室颤动的相关因素分析〔J〕.中国实验动物学报，2007;15(2):351-4.

8 李永秋，徐 明，姚绍鑫，等.实验性家兔颈动脉球囊扩张动脉狭窄动物模型的建立〔J〕.中国动脉硬化杂志，2003;11:263-6.

9 吴建秋.腹主动脉瘤动物模型研究进展〔J〕.中国动脉硬化杂志，2001;9:264-7.

10 周吉林，钟炳棠，黄 悦，等.猪心的应用解剖〔J〕.浙江医科大学学报，1998;27:254-6.

11 张 晶，傅向华.小型猪急性心肌梗死后心力衰竭模型的构建〔J〕.中国实验动物学报，2010;18(1):33-36.