鹰嘴豆-金属硫蛋白拮抗小鼠骨髓干细胞铅毒性的机制

于立博 刘继文 (新疆医科大学公共卫生学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

金属硫蛋白(MT)存在于除结缔组织外的所有真核生物中，是一种分子量较小(6 000～7 000 D)、富含半胱氨酸的非酶蛋白质〔1〕。MT具有强的抗氧化、重金属解毒等特性。由于其广泛的生理功能，自上世纪50年代被发现以来MT就成为生物化学及生命科学领域的研究热点。有研究显示，外源性的金属硫蛋白能够拮抗铅毒性〔2〕，但是MT拮抗铅毒性的机制还不是十分清楚。本实验利用从植物中提取的MT对染铅小鼠的骨髓间充质干细胞进行干预，探讨MT拮抗铅毒性的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 鹰嘴豆由新疆木垒县大龙王食品有限公司提供。

1.2 仪器及试剂 Cintra 10e型Uu-Visible Spectrometer(紫外扫描仪，美国)，HITACHI 20Pr-52D型低温冷冻离心机，日立Z-7000型偏振塞曼原子吸收分光光度计，血红蛋白(Sigma公司产品)，CdCl22.5H2O(分析纯，西安化学试剂厂)，pH=8.6Tris-Cl(Sigma公司产品)，95%乙醇(分析纯，西安化学试剂厂)。酶联免疫检测仪，流式细胞仪(FCM，Flow cytometry)，1640培养基(Gibco Life公司)，96孔板，Mtt试剂盒与凋亡试剂盒均购于南京建成生物公司。

1.3 样品处理及类MT的提取 将鹰嘴豆籽粒在液氮存在下碾碎后过80目筛，称取样品粉末 1.0 g，加入 10倍体积0.1 mol/L pH8.6的Tris-HCl缓冲液后于4℃冰箱过夜抽提。抽提液于4℃下，12 000 r/min离心30 min，收集上清液。上清液于100℃水浴加热1 min，迅速冷却。再于4℃ 10 000 r/min离心20 min，收集上清液，加入3倍体积的－20℃的预冷无水乙醇，－20℃过夜。过夜沉淀后，于4℃ 12 000 r/min离心20 min。取沉淀加入5 ml 0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液溶解数小时，所得溶液即无细胞类MT提取液。取以上类MT提取液装入透析袋中，在聚乙二醇-600(PEG-600)中透析浓缩。浓缩液经高效液相柱层析，离子交换层析脱盐后收集纯化MT分离液。收集的分离液于低温进行冷冻干燥制成冻干粉待用。

1.4 小鼠骨髓干细胞的培养 取同窝出生3 d的昆明种小鼠两只，断颈处死后用75%酒精消毒处理，后剪开皮肤并取下股骨。超净台中，于培养皿中剥去小鼠股骨周围筋膜及肌肉，用PBS洗3～5遍，用5 ml注射器吸取无血清培养液后将针头扎入骨髓中将骨髓吹出，吹出的骨髓置于离心管中，于常温下1 000 r/min离心5 min。离心后弃去上清液，于沉淀中加入含有10%胎牛血清的1640培养基吹打混匀后移入培养瓶中，于37℃CO2孵育箱中进行培养，2～3 d换液1次。荧光显微镜下观察，待细胞增殖稳定融合达到80%以上时，将细胞转移至6孔板进行培养，即进行干预实验。

1.5 受试物剂量及分组 通过MTT预实验测得铅的细胞半数致死剂量IC50=200 μg/L，取其1/5作为细胞染毒的剂量即0.04 μg/ml。取以上MT冻干粉溶于细胞培养基中配成终浓度为 0.01，0.005，0.001，0.000 5、0.000 1 g/ml 5 个浓度组，空白对照组(含同一细胞密度的培养液)和本底对照组(等体积含相应浓度MT的无细胞培养液)及标准对照组(含同一细胞密度的标准MT培养液)。每孔中加入100 μl醋酸铅溶液同时分别加入同体积的相应浓度的MT溶液，分别于24、48和72 h观察细胞活力及凋亡情况。最后在酶联免疫吸附法检测仪上测定490 nm波长各孔光吸收值A490，记录结果。计算生长抑制率(按以下公式)。细胞生长抑制率=(空白对照组A均值－实验组A均值)/空白对照组A均值×100%。实验重复3次。

1.6 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 细胞活力的测定结果 对染毒24 h细胞，受试物0.001、0.05、0.01 g/ml浓度组的A值低于空白对照组(P＜0.05);对染毒48 h细胞，受试物0.001、0.05、0.01 g/ml浓度组A值均低于空白对照组，而0.000 1与0.000 5 g/ml浓度组A值与空白对照组比较无差异(P＞0.05);对染毒72 h细胞，受试物0.005、0.001、0.05、0.01 g/ml浓度组 A值低于空白对照组(P＜0.05)，只有0.000 1 g/ml浓度组A值与空白对照组比较无差异(P＞0.05)。见表1。

2.2 MT对细胞凋亡的影响 用AV(AnnexinⅤ-FITC)和碘化丙啶(PI)双染24，48，72 h细胞，用0.01和0.05 g/ml MT干预作用24 h后，3个时间细胞的凋亡率均明显高于空白对照组(P＜0.01)，其中干预效果最好是24 h、0.01 g/ml组，凋亡率为11.60%。见表2、图1。

表1 MT对细胞活力的影响(s)

表1 MT对细胞活力的影响(s)

与空白对照组比较:1)P＜0.05，下表同

组别 A值抑制率(%)24 h 48 h 72 h空白对照组24 h 48 h 72 h 0.445±0.038 0.376±0.019 23.34 3.68 5.05 0.407±0.018 0.462±0.025 0.396±0.041 － － －0.01 g/ml组 0.154±0.0251) 0.148±0.0101) 0.196±0.0231) 62.16 67.97 50.50 0.005 g/ml组 0.201±0.0111) 0.265±0.0181) 0.211±0.0251) 50.61 42.64 46.72 0.001 g/ml组 0.253±0.0281) 0.352±0.0631) 0.256±0.0251) 38.57 23.80 35.36 0.000 5 g/ml组 0.300±0.0581) 0.420±0.047 0.350±0.016 24.29 9.13 11.62 0.000 1 g/ml组 0.312±0.0211)

图1 24、48、72 h染铅细胞凋亡的流式细胞术分析

表2 MT对染铅细胞凋亡的影响( s，%)

表2 MT对染铅细胞凋亡的影响( s，%)

0.10±0.31 0.70±0.01 2.40±0.11 0.01 g/ml组 11.60±1.311) 12.50±1.21 20.06±1.241)0.005 g/ml组 22.70±1.231) 21.70±1.151) 28.60±1.451)24 h 48 h 72 h空白对照组组别

3 讨论

铅是一种重金属，在人体没有任何生理作用并且具有细胞毒性，铅进入细胞后会引起细胞发生氧化应激反应，破坏线粒体使细胞膜的通透性增加，最后导致细胞崩解死亡〔3〕。目前临床上治疗铅中毒大多是采用巯基络合物，络合物进入体内后可结合重金属，但是同时会产生副作用，干扰体内其他矿物质的代谢。MT是一种存在于正常人体中的小分子蛋白质，含有大量巯基，具有强的与重金属离子铅结合的特性，具有捕获自由基，抗氧化应激抗凋亡的作用〔4〕。因此当外源性MT存在时就可以和细胞内的重金属铅离子结合，从而减轻铅对细胞的毒性作用，本研究结果提示外源性植物MT确实能够拮抗铅的细胞毒性，增强细胞活力，但是具体机制有待进一步研究。

1 Kagi JHR.Metallothionein proceeding of the first international meeting etallothein and other molecular weight metal bring protein〔J〕.Experientia，1979;12(3):17.

2 茹柄根.金属硫蛋白〔J〕.生物化学与生物物理进展，1991;18(4);254-89.

3 Thonalley P，Vasak M.Possible role for metallthionein in protection against radiation-induced oxidative stress kinetics and mechanism of reaction with superoxide and hydroxyl radicals〔J〕.Biophy Acta，1985;827:36-44.

4 于 东，丁世彬，廖 丹，等.金属硫蛋白排铅和肝脏保护作用的实验研究〔J〕.工业卫生与职业病，2012;38(3);150-3.