D-半乳糖诱发的衰老对大鼠下颌下腺p16/Rb细胞信号转导通路的影响

葛志华 李俊玫 于海忠 杨 宁 杨佳宁 崔宙开 王春艳

(承德医学院附属医院科研处，河北 承德 067000)

衰老对细胞信号传递系统的影响主要表现在对细胞周期进程及与细胞生长增殖相关的转录调控因子功能的影响。与衰老有关的细胞周期调控信号因子及途径多而复杂，且与细胞的类型和组织来源有关。其中p16/Rb信号通路、p53/Rb信号通路起着重要作用。下颌下腺是具有内、外双重分泌功能的腺体，它在内环境自稳机制中发挥其独特的作用。关于衰老下颌下腺组织中Rb细胞转导通路蛋白的表达国内外尚未见报道。本实验观察衰老大鼠下颌下腺组织磷酸化cyclinD1蛋白、p16、非磷酸化Rb蛋白的表达变化。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 MK3酶标仪:芬兰雷勃公司，PCR仪:美国MJResearch公司，DYY-6B型稳压稳流电泳仪:德国Leica公司。磷酸化cyclinD1抗体:上海迈新生物科技有限公司;p16和非磷酸化Rb单克隆抗体:北京中杉金桥生物有限公司。

1.2 实验动物的选择及分组 实验大鼠购自河北省实验动物中心，合格证编号:605106，选用8周龄清洁级SD雌性大鼠30只，体重180～220 g，随机分为正常组和模型组，每组15只。

1.3 模型的建立及各组动物的处理方法 正常组大鼠正常喂60 d。模型组大鼠腹腔注射6%D-半乳糖(300 mg·kg－1·d－1)，连续 60 d。

1.4 取材、固定及免疫组织化学染色 大鼠经10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉后，开胸，经左心室插管入主动脉，生理盐水冲净血液后，用4%多聚甲醛进行灌注固定、取双侧下颌下腺，常规ABC免疫组织化学染色显示磷酸化cyclinD1蛋白的表达。

1.5 Western印迹法检测p16INK4a、非磷酸化Rb蛋白含量 提取下颌下腺细胞总蛋白，测定各实验组总蛋白含量，分装储存;电泳分离蛋白质至溴酚蓝移动至胶底部终止。将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上;封闭PVDF膜分别加入Rb、p16单克隆抗体(抗体稀释度:1∶200)，室温2 h;放入杂交盒，加入HRP标记相应二抗(抗体稀释度:1∶2 000)，孵育1 h;将PVDF膜平铺、显色、曝光、显影、定影。将条带扫描至计算机中，用软件Bandscan5.0进行半定量分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件。计量资料描述采用s，组间比较行单因素方差分析。

2 结果

2.1 下颌下腺磷酸化cyclinD1蛋白含量的改变 磷酸化cyclinD1蛋白在正常及实验组大鼠下颌下腺的腺泡细胞、颗粒曲管及其他导管上皮细胞中均有表达，磷酸化cyclinD1阳性颗粒散在分布于细胞质内，呈黄色或棕黄色，见图1，模型组磷酸化cyclinD1蛋白的表达比较正常组明显降低(P＜0.01)。

图1 各组下颌下腺cyclinD1蛋白表达(DAB，×400)

2.2 p16INK4a和非磷酸化Rb蛋白含量检测结果 Rb表达以模型组明显高于正常组(P＜0.01);p16表达模型组比较正常组明显升高(P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠下颌下腺cyclinD1、p16、Rb的表达( s，n=15)

表1 各组大鼠下颌下腺cyclinD1、p16、Rb的表达( s，n=15)

与模型组比较:1)P＜0.01

分组 cyclinD1 P16(OD)Rb(OD)正常组 54.78±4.841) 0.48±0.021) 0.81±0.031)模型组19.11±2.21 1.94±0.02 1.69±0.03

3 讨论

细胞衰老是随着时间的推移，细胞增殖能力和生理功能逐渐下降的变化过程。细胞衰老过程受控于细胞信号传递系统。衰老对细胞信号传递系统的影响主要表现在对细胞周期进程及与细胞生长增殖相关的转录调控因子功能的影响。研究发现p16INK4a-pRb和ARF-p53这两条细胞调控通路与细胞衰老过程密切相关〔1〕，任何一条通路的阻滞，都能让细胞的周期出现停滞。

细胞周期的进程受cyclin、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物(CKI)等调控因子及相互作用的调节。cyclinD1是G1期蛋白，在G1期和G1/S期交界处发挥作用，与CDK4/CDK6形成复合体催化Rb蛋白磷酸化。Rb蛋白对细胞周期中最关键的调控点G1/S期、G2/M期起着“闸门”的作用，Rb蛋白磷酸化后失活，释放核转录因子E2F，游离的E2F启动G1/S期转换相关基因表达，推动细胞周期的进程。p16INK4a基因是CDKI基因家族成员，其产物p16INK4a蛋白可以特异性的与CDK4/CDK6结合，抑制CDK4/CDK6介导的视网膜母细胞瘤pRb的磷酸化，非磷酸化的Rb与转录因子E2Fs结合，进而阻止细胞由G1期进入S期启动染色体的复制，使细胞周期停滞〔2〕。Krishnamurthy 等〔3〕提出 p16INK4a的表达能够作为生理上的衰老的一个标志物。有研究表明，在衰老大鼠睾丸组织Rb基因和p16蛋白表达明显增高，p-Rb蛋白表达明显降低〔4，5〕。刘维潮等〔6〕研究显示，在衰老大鼠脑组织p16蛋白表达较正常组明显增高，p-Rb蛋白表达较正常组明显降低。

另有研究〔7〕表明，在衰老的人成纤维细胞中CDKI因子增多，cyclinD mRNA水平比休眠细胞高很多倍，这必然导致过量的cyclinD产生，但多为无活性的cyclinD/CDK4复合物，而磷酸化cyclinD却比休眠细胞少得多，而只有这种磷酸化的cyclinD才可以提高复合物的活性。衰老细胞中虽然CDK2总磷酸化水平不变，但cyclinD、E-CDK中的磷酸化水平却下降，从而导致细胞停滞于G1期。

本研究提示D-半乳糖可能通过诱导cyclinD蛋白非磷酸化、提高p16蛋白含量以促进Rb蛋白磷酸化等多个环节加速了通过p16/cyclinD/CDK4-CDK6/Rb/E2F途径对Rb蛋白的非磷酸化，阻滞细胞增殖，导致衰老。

综上，D-半乳糖诱发的大鼠下颌下腺细胞衰老与Rb/p16细胞转导通路的阻滞密切相关。

1 王 芳，关云谦.p16ink4a/p14ARF基因在细胞衰老和肿瘤抑制中的作用研究进展〔J〕.首都医科大学学报，2011;32(1):100-5.

2 Lea NC，Orr SJ，Stoeber K，et al.Commitment point during Go-G，that controls entry into the cell cycle〔J〕.Mol Cell Biol，2003;23(7):2351-61.

3 Krishnamurthy J，Torrice C，Ramsey MR，et al.Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging〔J〕.J Clin Invest，2004;114:1299-307.

4 牛嗣云，陈 龙，高福禄，等.P53PRb细胞转导通路相关基因和蛋白在衰老大鼠睾丸组织的表达〔J〕.解剖学报，2008;39(6):841-4.

5 牛嗣云，庞晓静，高福禄，等.松花粉对衰老大鼠睾丸p53/Rb细胞转导通路相关基因和蛋白表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(14):1780-2.

6 刘维潮，王 静，王双辉，等.何首乌饮对衰老大鼠脑组织Rb细胞转导通路相关蛋白表达的影响〔J〕.承德医学院学报，2009;26(4):454-5.

7 Dulic V，Drullinger LF.Altered regulation of G1 cyclin in senescent human diploid fibroblasts〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1993;90:11034.