HPLC法测定大鼠血浆中曲安奈德的含量

谢静,张迎庆

(湖北工业大学食品与制药工程学院,湖北 武汉 430068)

曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA),属于肾上腺糖皮质类固醇,分子式为C24H31FO6,为白色或类白色结晶性粉末.作为一种糖皮质激素,曲安奈德具有较强的抗炎和免疫抑制作用[1],用于治疗各种皮肤病、过敏性鼻炎、关节疼痛、支气管哮喘、肩周炎、急性扭伤及眼科炎症等[2].关于曲安奈德含量测定的文献多有报道[3-4],而对其在大鼠血浆中进行含量测定的方法报道则较为少见,本文中采用高效液相色谱法对大鼠血浆中的曲安奈德进行分析,试图建立有效可行的含量测定方法,为之后该类药物的体内血药浓度检测及药动学研究提供实验依据.

1 仪器与材料

1.1仪器高效液相色谱仪(Ultimate 3000,美国Dionex公司);Chromeleon色谱工作站(美国Dionex公司);高频数控超声波清洗器(KQ-300TDB,昆山市超声仪器有限公司);电子分析天平(AR 3130型,梅特勒-托利多仪器上海有限公司).

1.2药品与试剂曲安奈德原料药(NET 101101,天津天药药业股份有限公司);曲安西龙(内标,天津天药药业股份有限公司);乙酸乙酯(分析纯);甲醇(色谱纯).

1.3实验动物SPF级Wistar 雌性大鼠,体重250～300 g,湖北省实验动物研究中心提供,动物许可证号:4200600867.

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 曲安奈德标准溶液 精密称定曲安奈德原料药适量,用流动相溶解得到浓度为100 μg/mL的标准储备液,置4 ℃下,用前避光.

2.1.2 内标溶液 精密称定曲安西龙适量,用流动相溶解得到浓度为50 μg/mL的内标储备液,置4 ℃下,用前避光.

2.2血浆样品的处理于大鼠股动脉活体取血后即时离心(10 000 r/min),取上层血清,置-20 ℃下备用,用前解冻.精密吸取血浆样品0.2 mL,置5 mL具塞离心管中,加入乙酸乙酯2 mL,摇匀,旋涡混合10 min,离心(8 000 r/min)后取上层有机相1 mL,挥干,残渣用0.2 mL流动相溶解,旋涡混合5 min后,半透膜(20 ku)过滤,20 μL进样,HPLC测定.

2.3 血浆中曲安奈德HPLC测定方法的建立

2.3.1 色谱条件 色谱柱:Dionex C18柱;流动相:甲醇∶水=57∶43(体积分数);检测波长:240 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:20 μL.

2.3.2 专属性考察 在上述色谱条件下,空白血浆、空白血浆加曲安奈德和内标溶液、血浆样品的色谱图、未添加曲安奈德的血浆样品色谱图如图1所示.结果表明,血浆中的内源物质不干扰曲安奈德及内标的分析测定.

2.3.3 血浆中曲安奈德标准曲线的绘制 精密量取曲安奈德(TA)对照品溶液,用流动相分别稀释成浓度为0.6、3.0、6.0、24.0、96.0、192.0 μg/mL,分别取50 μL,加入大鼠空白血浆200 μL及内标溶液(internal standard,IS)50 μL,配制成0.1、0.5、1.0、4.0、16.0、32.0、64.0 μg/mL的系列曲安奈德血浆标准溶液.按“2.2血浆样品的处理”项下操作,进样分析,得数据结果如表1.以血浆药物浓度为横坐标(x),以曲安奈德与内标峰面积比为纵坐标(y),得线性回归方程为:y=0.019 9x+0.048 1(相关系数r=0.996 1).血浆中曲安奈德的浓度在1～64 μg/mL范围内,其峰面积和对应的浓度呈现良好的线性关系,见图2.

表1 不同浓度下的曲安奈德及内标与峰面积的关系

图2 血浆中曲安奈德含量测定标准曲线

2.3.4 回收率实验 取大鼠空白血浆200 μL配制血浆药物浓度分别为8、10、12 μg/mL的样品,加内标50μL每一浓度平行制备3份,按“2.2血浆样品的处理”项下操作,进样分析,得到的峰面积代入标准曲线方程求得实际浓度,实际浓度与理论浓度的比值即为方法回收率.上述低、中、高3个样品的方法回收率结果见表2.

表2 血浆中曲安奈德含量测定的回收率实验结果

2.3.5 精密度试验 对血浆药物浓度分别为4、16、64μg/mL的样品进行日内及日间精密度考察.每一浓度的样品平行制备3份,按“2.2血浆样品的处理”项下操作,进样分析,测定峰面积,计算同一天内3个浓度的日内相对标准误差(RSD).连续5天每一浓度样品进样3次,测定峰面积,计算日间相对标准误差(RSD).结果见表3,同一浓度下的相对标准偏差在3%以下,均符合生物样品指导原则的有关规定[5].

表3 血浆中曲安奈德含量测定的精密度试验结果

2.3.6 重复性试验 取同一天配制的对照品溶液,大鼠血浆200μL配制血浆药物浓度为10μg/mL的样品6份,按“2.2血浆样品的处理”项下操作,进样分析,结果见表4.结果得到的相对标准偏差为2.95%,表明重复性较好.

表4 血浆中曲安奈德含量测定的重复性试验结果

2.3.7 稳定性试验 取大鼠空白血浆200μL,分别加入曲安奈德系列对照品溶液,制成血浆药物浓度分别为4、16、64 μg/mL的样品,按“2.2血浆样品的处理”项下操作,分别于0、6、12 h进样分析,记录色谱峰面积,见表5.结果表明样品室温放置12 h稳定.

表5 血浆中曲安奈德含量测定的稳定性试验结果

3 小结

目前常用的血浆样品预处理方法有液-液提取法、液固提取法、直接除蛋白法等.因曲安奈德为亲脂性较强的药物,可溶于多种有机溶剂,本试验选用液-液提取法.在血浆样品提取过程中,比较了氯仿和乙酸乙酯,发现氯仿对曲安奈德的提取率相当低,HPLC测定中几乎无药物峰出现,而乙酸乙酯的提取率很高,回收率试验中其平均提取回收率在90%以上,同时曲安奈德与内标物及血浆内源物质分离度高,实验结果准确可靠,证明该方法作为大鼠血浆中曲安奈德含量测定的方法是有效可行的.

[1] 彭穗伟,李益中.曲安奈德的药理作用及临床作用[J].新医学,2001,32(1):45-46.

[2] 陈新谦,金有豫,汤光,等.新编药物学[M].人民卫生出版社,2011:626.

[3] Pan Zu-ting, Yu Jun-ping. Spectrofluorimetric method for the determination of triamcinolone acetonide[J]. Wuhan University Journal of Natural Sciences,2004,9(3):353-358.

[4] 钟小燕.HPLC法测定醋酸曲安奈德薄荷软膏中醋酸曲安奈德的含量[J].中国当代医药,2012,19(19):79-82.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:二部[M].北京:化学工业出版社,2005:173-179.