骚扰库蚊内蒙古新记录及其感染Wolbachia的检测*
2013-11-19赵彤言
邢 丹 赵彤言
(军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071)
骚扰库蚊Culexpipipensmolestus，与淡色库蚊Cx.pipienspallens、尖音库蚊Cx.pipienspipiens和致倦库蚊Cx.pipiensquinquefasciatus均属于库蚊属genusCulex库蚊亚属subgenusCulex尖音库蚊复合组。骚扰库蚊是尖音库蚊复合组的一个亚种，与该复合组其余成员不同的是，骚扰库蚊是自育性蚊虫，即完成第1次生殖周环不需要吸血。国内学者对骚扰库蚊分类学方面的研究较为详细(赵彤言等，1993；1994；1996；1998)。在我国北京、上海、沈阳和赤峰地区均有发现骚扰库蚊。骚扰库蚊与淡色库蚊不存在地理隔离，属同域分布，且两者之间的成虫和幼虫在形态上极为相似，不易区分，雄蚊阳茎的形态特征是两者鉴定的重要依据。在日常病媒生物监测及控制工作中，在没有正确分类的情况下，骚扰库蚊通常被当做淡色库蚊来处理(赵彤言等，1993；王丽珠等，1993；海秀平等，2007；姬淑红等，2010)。作者从内蒙古满洲里地区发现并采回自育性尖音库蚊复合组蚊虫，将其带回实验室进行饲养传代，并进行自育性和雄蚊阳茎形态特征的研究，确认其是是否是骚扰库蚊。
昆虫共生微生物Wolbachia是一类胞质遗传的立克次体，其广泛存在于节肢动物体内，可引起宿主的大量遗传改变。Wolbachia改变和影响着其宿主的繁殖，包括诱导宿主间杂交的胞质不融合，诱导单性生殖和雌性化。wsp基因是目前报道的Wolbachia基因中进化最快的一个基因，由于特定基因区段的PCR特异性扩增已经成为鉴定昆虫体内共生菌的常规途径，即可依据wsp基因对Wolbachia进行PCR检测来说明昆虫体内感染Wolbachia共生菌的情况。据报道我国尖音库蚊复合组蚊虫中Wolbachia感染现象十分普遍，北京地区骚扰库蚊的雌蚊和雄蚊均感染Wolbachia(宋社吾等，2000；2002；2002)。为了解野外采集到的骚扰库蚊Wolbachia的侵染情况，以及它与不同地区的骚扰库蚊感染情况是否相同，为将来在生物防治上利用Wolbachia提供依据，本文对其进行了Wolbachia的PCR检测。
1 材料与方法
1.1 试虫来源
本研究实验用虫来源于2009年7月上旬在内蒙古满洲里市扎赉诺尔区扎煤总医院暖气管地下井内采集到的幼虫，羽化后初步鉴定为尖音库蚊复合组蚊虫，饲养后发现蚊虫生殖为自育性，带回本单位实验室进行常规饲养和传代。
1.2 自育性实验
选择羽化后雌、雄蚊各40只，置于30 cm×30 cm×40 cm的蚊笼内，饲喂5%糖水，并放入收卵杯，每日观察有无产卵，每日收集到的卵块单独饲养并记录卵块数、卵数和孵化幼虫数，观察其孵化率及自育率。
1.3 尾器标本制作和测量
取出雄性成蚊标本，在回软器中，回软24 h。用剪刀剪下腹部，至于小平皿中，加10%KOH溶液浸泡12 h，然后用蒸馏水冲洗3次。将冲洗后的腹部，用35%、55%、75%、95%酒精和无水乙醇，逐级脱水，每次30 min。在载玻片上滴小滴加拿大树胶酚，将脱水后的腹部面朝上置于胶中在解剖镜下解剖取出第八腹节以前的腹部，摆正位置。稍干后盖上盖玻片。在光学显微镜下观察和测量D、V值，并计算DV/D值。
1.4 蚊虫总DNA的制备
随机挑选48只雌雄各半的野外采集到的骚扰库蚊标本，采用宝生物工程(大连)有限公司的DNA提取试剂盒，提取单只蚊虫的基因组总DNA。
1.5 蚊虫体内Wolbachia的wsp基因片段的PCR扩增
使用wsp基因通用引物从Wolbachia品系中扩增出590～632 bp左右的目的片段(宋社吾等，2000)。通用引物为：81F 5′-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3′和691R 5′-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3′。扩增体积为50 μL，包括PCR SuperMix(上海英俊生物有限公司)45 μL，正向、反向引物(20 μmol/L) 各1 μL，模板DNA为3 μL。PCR 扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min， 72℃ 1 min， 扩增35个循环；最后72℃延伸7 min。扩增反应结束后，取5 μL PCR 产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像系统检测并摄影。
2 结果
2.1 骚扰库蚊雄蚊阳茎形态
内蒙古满洲里地区骚扰库蚊雄蚊阳茎的特点与尖音库蚊雄蚊阳茎的特点相同，即阳茎内叶端角外伸，部分短而呈钩状，中叶末端平齐。而其与淡色库蚊在形态上存在很大差异，后者阳茎内叶端角外伸部分长而宽呈叶状，中叶末端圆钝。如图1所示。
图1 显微镜下骚扰库蚊雄蚊阳茎(采集地：满洲里)Fig.1 Male genitalia of Cx. pipipens molestus under microscope in manzhouli,Inner Mongolia
2.2 自育性实验结果
内蒙古满洲里地区的骚扰库蚊为自育性蚊虫，40只雌蚊收集卵块29块，自育率为72.50%，其中总产卵蚊数为2 126枚，总孵化幼虫数为1 888只，孵化率为88.76%，平均每雌产卵65.1枚(表1)。
表1 骚扰库蚊卵孵化结果Tab.1 Hatching result of Cx. pipipens molestus eggs
2.3 骚扰库蚊阳茎DV/D值
骚扰库蚊雄蚊阳茎DV/D值如表2所示，由表中可以看出30个标本中的DV/D值在-0.0648与0.0577之间。
表2 骚扰库蚊雄蚊阳茎DV/D值Tab.2 The ratio of DV/D of male genitalia of Cx. pipipens molestus
图2 骚扰库蚊体内Wolbachia的wsp基因的PCR产物电泳图Fig.2 Eletrophoresis of PCR products amplified using wsp specific primers on genomic DNA of Wolbachia harbored by Cx. pipipens molestus
2.4 骚扰库蚊Wolbachia的PCR扩增
运用Wolbachia的wsp基因的通用引物81F和691R，成功从内蒙古满洲里地区的野外种群总DNA中扩增出600 bp左右的目的片段。由图2可见，48只骚扰库蚊中感染Wolbachia的有38只，感染率为79.17%。其中1～12与25～36为雄蚊，13～24与37～48为雌蚊；雌雄个体均有检测到Wolbachia的目的条带，感染率分别为70.83%和87.5%。将扩增到的PCR产物送测序公司进行测序，测序结果经BLAST比对确定为wsp基因序列。
3 讨论
骚扰库蚊一般是孳生于污水渗井等地方，也有文献报道在明沟中发现其孳生(姬淑红等，2010)。我国尖音库蚊复合组雄性外生殖器的形态大致可以分为3个类型：尖音库蚊型，其特点是阳茎内叶端角外伸部分细短而呈钩状，中叶末端平齐；淡色库蚊型，其特点是阳茎内叶端角外伸部分长宽而呈叶状，中叶末端圆钝或平齐；致倦库蚊型，其特点是阳茎内叶外伸部分也呈宽叶状，而中叶末端削尖(陈汉彬，1988)。在这些类型进一步鉴别中，常利用雄蚊阳茎DV/D的数值进行判断，认为DV/D<0.2为尖音库蚊，0.2
各种节肢动物体内Wolbachia的感染情况呈现多样性，据报道Kondo等(2002)检测的绿豆象Callosobruchuschinensis感染率为100%；Turelli等(1995)检测的拟果蝇Drosophilasimulans感染率为94%；赤眼蜂科Trichogrammakaykai的感染率为20%(Stouthameretal.，1994)，而赤眼蜂科T.deion感染率仅有0.88%(Huigens，2003)。关于昆虫感染Wolbachia的研究较多，据文献报道不同地区昆虫种类中的Wolbachia感染率在16.7%与57.1%之间，其中蝴蝶种类的感染率最低为16.7%，而朱砂叶螨感染率最高为57.1%(苗慧等，2004)。而就骚扰库蚊而言，在我国只对尖音库蚊复合组的4个亚种实验室种群及采集于我国华北、华东和华南的尖音库蚊复合组不同地理株蚊虫中Wolbachia的侵染做过研究，但并未对该复合组4亚种蚊虫的感染率进行测定(宋社吾等，2000)。本文通过随机选取48只内蒙古满洲里采集到骚扰库蚊进行Wolbachia的PCR扩增，与苗慧等文中的不同昆虫的感染率相比，其感染率明显高于其他昆虫，说明较其他昆虫来讲骚扰库蚊中的Wolbachia侵染十分严重，同时也说明Wolbachia广泛存在于骚扰库蚊雌蚊和雄蚊中。骚扰库蚊野外采集到的雌雄个体均能感染Wolbachia，但其感染情况存在差别，这可能跟其所处环境、自育性、诱导生殖不亲和、胞质不融合、诱导孤雌生殖、雄性致死、雌性化和调节繁殖力等相关。
