昆明地区尖音库蚊复合组蚊虫分子鉴定

王娟，元正菊，何于雯，李楠，孟锦昕，王静林

(云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224)

尖音库蚊复合组蚊虫是危害人畜的重要昆虫媒介，通过叮咬传播西尼罗病毒性脑炎、乙型脑炎、圣路易斯脑炎、禽疟疾、班氏丝虫等多种疾病[1-4]。尖音库蚊复合组蚊虫包括尖音库蚊指名亚种(CulexpipienspipiensLinnaeus,1758)、致倦库蚊(Cx.pipiensquinquefasciatusSay,1823)、淡色库蚊(Cx.pipienspallensCoquillett, 1898)和骚扰库蚊(Cx.pipipensmolestusForskal, 1775)等4种蚊虫[5]。4种蚊虫在全世界广泛分布，在我国也有分布，典型的尖音库蚊分布在新疆，淡色库蚊分布于北方地区(北纬 32°～34°以北)，致倦库蚊分布于我国的南方地区(北纬32°～34°以南)以及南方岛屿如台湾岛和海南岛，淡色库蚊和致倦库蚊地区分布存在一定的交差重叠[5-8]。由于这4种蚊虫的形态学比较相近，采用传统的形态学方法难以准确地对它们进行分类，有关致倦库蚊、淡色库蚊的分类地位等问题一直存在争议[9]。近年来，随着分子生物学技术的发展，国外不少学者应用线粒体I(COI)DNA序列分析作为一种研究昆虫系统进化关系的手段，并有一些蚊虫系统进化关系研究的报道[10,11]。为此，将采用分子生物学方法对采集自昆明地区的蚊虫进行分子鉴定，从分子水平明确昆明地区尖音库蚊的分类地位。

1 材料与方法

1.1 蚊虫采集

于2017年5月17日—21日在云南省畜牧兽医科学院家属区室内采集蚊虫标本。在19：30—22：30，采用人诱法用电动吸蚊器捕捉蚊虫，把采集的蚊虫放入-20℃冰箱中冰冻30 min，在体视显微镜下观察蚊虫的形态特征，并参照《中国重要医学昆虫分类与鉴别》[12]进行分类鉴定，然后把蚊虫浸泡在70%乙醇中，-20℃冰箱保存。

1.2 蚊虫基因核酸提取和基因扩增

在采集到的淡色蚊虫标本中随机抽取10只蚊虫标本进行基因组DNA提取。具体提取方法如下：从乙醇中取出蚊虫标本放入无菌玻璃研磨器中，让蚊虫表面乙醇稍稍挥发，除去蚊虫翅膀和足，用基因组DNA 提取试剂盒(天根公司) 按照说明书提取蚊虫基因组DNA。参照文献引物分别对昆明淡色库蚊COI[11]、COII[11]和ITS[3]基因进行PCR扩增。50 μL 反应体系: DEPC处理水32 μL , 10×rTaq 缓冲液 5 μL，上下游引物各(20μmol/L) 1.25μL，2.5mmol/L dNTP 5μL，rTaq 酶0.5μL (2.5U)，模板5μL。COI和COII基因PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 60s，35个循环，72℃延伸10min。ITS基因PCR扩增程序退火温度为55℃，其余程序与COI和COII基因扩增程序相同。取5μL PCR 扩增产物点样，1%琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物送测序公司(擎科生物)进行测序。

1.3 序列分析

采用 DNA Star 软件中SeqMan拼接序列，使用MEGA X 软件中Aling 进行序列比对和DNA Star软件中MegAlign进行核苷酸同源性分析。使用MEGA X 软件构建系统进化树，构建方法采用Neighbour-joining (NJ) 法，bootstrap值为1000。

2 结果

2.1 标本采集

2017年5月17日—22日在昆明市青龙山云南省畜牧兽医科学院家属区室内共采集到蚊虫标本50只，均为雌虫。

2.2 淡色库蚊形态学鉴定

50只蚊虫均具有相同的形态特征：中等大小，淡棕色；喙色暗，中段色淡，但喙无清楚界限的白环，腹节背板有淡色基带，淡色基带平齐并与腹侧板相连，前中后各跗节均为暗褐色，无淡色环。

图1 昆明尖音库蚊复合组蚊虫形态特征

2.3 分子鉴定

2.3.1核苷酸同源性分析

分别采用蚊虫COI、COII和ITS 3个基因特异引物对1只在昆明地区采集的尖音库蚊复合组蚊虫标本进行PCR扩增，3对引物扩增均为阳性，测序后分别获得COI、COII和ITS基因序列650个核苷酸(nt)、490nt和619nt。对昆明采集的尖音库蚊复合组蚊虫进行的核苷酸同源性分析结果显示，该只蚊虫COI基因、COII基因和ITS基因与尖音库蚊复合组的尖音库蚊、淡色库蚊、致倦库蚊和骚扰库蚊核苷酸序列同源性最高，分别在99.8%～100%、99.8%～100%、96.4%～99.9%，而与其他库蚊核苷酸同源性分别低于97.2%、96.5%和90%；进一步分析发现，昆明采集的蚊虫COI基因和COII基因与尖音库蚊、淡色库蚊、致倦库蚊和骚扰库蚊核苷酸同源性均在99.8%以上，ITS基因与尖音库蚊和骚扰库蚊核苷酸同源性较高在99.1%～99.9%，而与淡色库蚊和致倦库蚊核苷酸同源性在96.4%～96.6%，见表1。

表1 昆明地区采集蚊虫与尖音库蚊和其他库蚊核苷酸同源性分析

2.3.2遗传进化分析

云南省昆明市盘龙区采集1只蚊虫COI、COII和ITS基因分别与GenBank 中45条相应基因序列一起构建系统进化树(见图2)。结果显示在COI、COII和ITS 3个基因进化树上，昆明采集蚊虫M1与尖音库蚊复合组的尖音库蚊、骚扰库蚊、淡色库蚊和致倦库蚊一起位于同一进化分支内；在COI和COII基因构建的进化树上，尖音库蚊复合组的蚊虫形成4个进化分支，但该复合组的4种蚊虫难于从COI和COII系统进化树上区分开来，本研究采集蚊虫M1与尖音库蚊、骚扰库蚊、淡色库蚊和致倦库蚊部分蚊虫株位于一个较小进化分支之内；而在ITS基因构建的系统进化树上，尖音库蚊复合组的4种蚊虫形成三个较小的进化分支，昆明采集蚊虫M1与尖音库蚊和骚扰库蚊位于同一较小进化分支内。

3 讨论

蚊虫是医学和兽医学上重要的媒介昆虫，种类非常多，分布范围广泛，以热带、亚热带地区蚊虫种类最为丰富，蚊虫密度也较高。不同蚊虫种类或亚种传播人或动物疾病的效能存在明显差异，所以蚊虫种类、地理分布直接关系到人或动物疾病的传播、流行及分布[13]，因此，有必要对蚊虫进行准确的分类鉴定，对了解蚊虫传播疾病的流行和防控具有重要意义。本次研究在昆明地区采集到50只蚊虫，在形态上具有喙无清楚界限的白环、腹节背板有淡色基带且平齐或微凸或微凹与腹侧板相连、各足跗节全部色暗、无淡色环等特征，这与尖音库蚊复合组蚊虫形态特征相似，形态学鉴定这些蚊虫为尖音库蚊复合组蚊虫。

A.COI基因进化树；B.COII基因进化树；C.ITS基因进化树；NJ法构建系统进化树，bootstrap值为1000。

由于尖音库蚊复合组的4种蚊虫形态学上非常相似，从形态学上难以很好鉴别，容易导致相近蚊虫种类的错误分类[9]，因此，需要一种新的方法来准确鉴定蚊虫种类，而分子鉴定方法是一个不错的选择。目前，蚊虫分子鉴定常选用线粒体基因COI、COII、COIII以及ITS基因作为分子靶标进行分类鉴定[11]。鉴于此，本次研究选用线粒体基因COI和COII、ITS 3个基因作为分子靶标进行分子鉴定，遗传进化分析结果表明昆明采集的蚊虫M1与尖音库蚊复合组蚊虫遗传进化密切，从分子水平提示M1为尖音库蚊复合组蚊虫，但是采用COI和COII基因进行的遗传进化分析难以明确昆明采集的M1具体分类。而通过ITS基因遗传进化分析可以把尖音库蚊/骚扰库蚊、淡色库蚊、致倦库蚊鉴别开来，但不能很好鉴别尖音库蚊和骚扰库蚊。本次昆明采集蚊虫M1在ITS基因遗传进化关系中与尖音库蚊和骚扰库蚊较密切，同源性也非常高，提示昆明采集的M1蚊虫可能为与尖音库蚊或骚扰库蚊关系密切的蚊虫，其分类地位的确定还有待于进一步研究。

尖音库蚊复合组各亚种的形态特征很相似，鉴别的重要形态特征是雄性蚊虫生殖器阳茎侧板中叶的形态差异[14]。遗憾的是本次在昆明地区没有采集到雄性库蚊，因此，难以有效地对这批雌蚊进行亚种的鉴定。 为了填补这个遗憾，本研究同时扩增了蚊虫的COI、COII和ITS 3个基因，并进行系统的遗传进化分析，以期能够明确昆明地区尖音库蚊复合组的亚种，但是对这3个基因的分析还难以区别开尖音库蚊或骚扰库蚊。因此，为了更清楚地明确昆明地区尖音库蚊复合组蚊虫的亚种，还有待于在该地区采集雄蚊以及寻找更多的分子靶标开展进一步分类研究。