Smad蛋白研究进展

庞莉 王晶 蒋延文

转化生长因子β（transforming growth factor betas，TGFβs）超家族分布于人体各个系统，是调节细胞分化成熟过程的极其重要的一类生长因子。它对于多种细胞功能都有调节作用，其调节功能涉及到胚胎发育、对疾病和伤害的反应、成熟个体稳态的保持等多个方面，细胞的迁移、生长、分化和细胞凋亡等一系列状态[1]。TGFβs超家族的成员有抗苗勒氏管激素（anti-Muellerian hormone， AMH）、TGFβ、激活素、nodal、抑制素（Inhibins）以及骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins， BMPs）等等40余种[2-3]。早期研究已经显示，Smad蛋白能够被TGFβ诱导细胞膜受体直接激活，形成转录复合物，进一步控制转录核内的靶基因转录（见图1），细胞的多种分化成熟过程被调节。因此，它不但成为了TGFβ信号通路中的重要部分，同时共同调节细胞功能，通过汇合其他信号通路。近年来发现其与多种疾病尤其是多种恶性肿瘤发生、发展相关[2]。

1 Smad蛋白家族

1.1 组成和结构 大约500个氨基酸组成Smad蛋白，包含球形结构域两个，1个连接区。N-末端结构域（又称“mad-同源体1”，MH1）在所有R-Smad和Smad4中高度保守，而在Smad6和7中则例外。在不同的亚族中，C-末端（又称为MH2结构域）同MH1结构域一样高度保守[4]，但连接区的变化较大。人类和小鼠基因组中各自编码了8个Smad蛋白。Smad蛋白1、5和8属于TGFβs家族中AMH和BMPs的通路受体底物[5]，Smad2和Smad3是激活素、TGFβ、Nodal通路的受体底物。Smad4为所有R-Smad提供辅助。Smad6和Smad7能够干扰和破坏Smad-受体或者Smad-Smad连接形成复合物，属于抑制性Smad蛋白。Smad1、Smad2、Smad3、Smad5以及Smad8是受体调节Smad蛋白（receptor regulated Smads， RSmads），作为 TGFβs受体底物参与了哺乳动物信号传导通路[6]。

图1 TGFβs信号传导通路

有研究通过X线分析了Smad蛋白MH1和MH2的空间结构，所有R-Smad和Smad4中都是借助一个高度保守-发夹结构与MH1结构域链接。而Smad2蛋白含量最多的剪接体中，一段外显子3编码的插入片段能够阻止Smad蛋白与DNA结合。高度保守的Smad蛋白MH2结构域参与了信号转导过程中多种蛋白的相互作用。MH2结构表面的亲水区作用是控制核孔复合物（nuclear pore complex）、胞质内蛋白以及DNA结合辅助因子之间的相互作用。R-Smads C-末端含有保守的丝氨酸-X-丝氨酸模体，可以被磷酸化，链接受体和N末端形成了一个“口袋”状结构。横跨连接区和MH2模体区的部分被认为是Smad4蛋白激活区（Smad4 activation domain， SAD）能够调节转录激活和抑制因子的相互作用[7-8]。

1.2 Smad锚蛋白 目前发现的促进Smad蛋白与受体相互作用的几种锚蛋白中，作用最大的是Smad受体激活锚蛋白（smad anchor for receptor activation， SARA）[9]，它在细胞膜及早期内涵体膜上锚定Smad2/Smad3蛋白，以促进与激活的TGF相结合[10]。同时，还可通过特殊FYVE结构域蛋白-Hgs，与SARA一起借助协同作用促使Smad蛋白磷酸化。虽然Smad1/Smad5/Smad8与BMPs通路有关，但到目前为止仍然没有证据显示该通路上存在SARA样因子，帮助激活的受体与RSmad蛋白相结合[9]。

2 磷酸化与去磷酸化

2.1 Smad磷酸化受TGF受体激酶调控 TGF受体复合物活化后促进Smad蛋白磷酸化是TGF信号传导关键性的一步。TGF与TGFⅠ型（TR-Ⅰ）和Ⅱ型受体（TR-Ⅱ）成对结合，形成异源四聚体受体复合物，该复合物中TR-Ⅱ将TR-ⅠN末端的一个丝氨酸/苏氨酸富含区-GS区磷酸化。TR-Ⅱ在配体诱导的受体复合物中连接到TR-Ⅰ GS区，催化苏-苏-丝-甘-丝-甘-丝氨酸中的苏氨酸（或丝氨酸）残基磷酸化[11]）。磷酸化的GS区转变为Smad2/3结合区[12]，再次促使Smad2/3磷酸化传递信号。一个包含R-Smad蛋白MH2 L3环结构（L3loop）和Ⅰ型受体激酶结构域中L45环结构（L45loop）的特殊区域决定了R-Smad的底物特异性。L45loop决定磷酸化的GS区驱动受体特异性，调控与R-Smad相互作用。

位于R-Smad C末端的序列丝-缬-丝氨酸（在Smad2蛋白是丝-蛋-丝氨酸）发生受体调节的磷酸化反应，TGF-/Smad信号通路的标志就是这种磷酸化的丝氨酸-X-磷酸化丝氨酸结构，该模体既可以出现在Ⅰ型受体磷酸化的R-Smad蛋白C末端，也可以出现在Ⅱ型受体磷酸化的Ⅰ型受体GS区，此外，该模体还可以与C末端羧基配对形成双磷酸-丝氨酸结构，此结构可以同Smad4蛋白MH2区“口袋”结构连接[13]，构成R-Smad-Smad4寡聚体进入细胞核，达到调节靶基因转录目的。

2.2 去磷酸化过程 刺激TGF/BMP 15～30 min后，Smad2/Smad3磷酸化水平达到稳定状态（BMP通路中是Smad1/Smad5/Smad8）。当浓度稳定数小时后，细胞外TGF/BMP水平因受体失活或负反馈调节降低而逐渐导致Smad2/Smad3去磷酸化。Inman研究发现，存在一种快速受体去磷酸化回到细胞膜过程，那么当再次受到TGF/BMP等刺激时，则再次磷酸化脱离细胞膜磷酸化Smad蛋白水平逐渐通过循环达到稳定水平[14]。伴随着R-Smad-Smad4复合物的解离回到胞，细胞核内R-Smad蛋白去磷酸化。R-Smad蛋白调节同时包含，受体磷酸化-去磷酸化循环过程，细胞质内磷酸化的受体与Smad4蛋白形成复合物进入细胞核，进而调节靶基因转录，去磷酸化解离复合物，返回细胞质。RSmad蛋白去磷酸化后与细胞核内结合位点的亲和力降低，由细胞核内向细胞质迁移；与之相反，磷酸化后降低了与胞质锚定点亲和力的RSmad蛋白，解离后转移到细胞核内，由此在细胞核和细胞质之间穿梭往返[8]。确保了受体不断被磷酸化激活。

2.3 Smad蛋白调节 Smad蛋白活性受磷酸化C末端MH2结构域和磷酸化连接区来实现。R-Smad蛋白连接区包含多个可以被多种激酶（如ERK MAP激酶）磷酸化的丝氨酸和苏氨酸位点，磷酸化后的R-Smad则对信号的反应减低。R-Smad蛋白连接区的变异较大，使得上一级信号的选择性调控成为了可能。Zavala-Gongora R等[15]的报道连接区可迅速将Smad蛋白和几种不同的通路链接，但具体机制尚不十分清楚。

3 转录过程

3.1 形成转录复合物 R-Smad蛋白被受体磷酸化后并与Smad4蛋白形成复合物成为许多靶基因调节的关键因素，Smad蛋白需要与DNA连接辅助因子结合获得与DNA高度亲和力，然后该复合物才可以通过MH1结构域完成连接到DNA这一过程。

1998年，学者Zawel等[15]在一项研究中发现，DNA上特殊的5’-GTCTAGAC-3’序列可以和Smad蛋白结合，进一步研究中证实该序列为5’-GTCT-3’（或者是5’-AGAC-3’），简称SBE。许多Smad靶基因启动子区带有SBE，X线分析其空间结构后，证实Smad蛋白通过发夹结构与SBE结合。因为单一的SBE不能提供足够的亲和力以促进Smad蛋白结合，所以启动因子区通常带有多个SBE结构，可通过多个MH1与多个SBE结合以获得足够的DNA结合力[16]。所有的R-Smad蛋白和Smad4均可直接与DNA结合，同时，MH1结构域中的发夹结构可以调节Smad3蛋白与SBE的结合能力，发夹结构插入DNA螺旋结构大沟中，与SBE上的3个核苷酸通过氢键结合在一起[16]。和所有的R-Smad蛋白一样，Smad4的-发夹结构高度保守，这说明Smad蛋白与靶基因的结合不具有多样性。在脊椎动物中，其发夹结构的附近含有Smad2蛋白3号外显子编码的插入片段，它可以阻止Smad蛋白与DNA的结合；反之，缺少插入片段的剪接体则可以与DNA结合。

R-Smad-Smad4寡聚体调节Smad蛋白复合物的活性，通过分析包含C末端丝氨酸残基证实，两个磷酸化的R-Smad蛋白分子与一个Smad4蛋白分子形成异源三聚体构成寡聚体[17]，在X线分析复合物中磷酸化的MH2结构域中获得了相同的结论。在对体内内源性Smad转录复合物的分析中发现，复合物的组成表现的更为复杂，因受到与复合物中的其他因子和不同靶基因的影响，可形成异源二聚体和三聚体。

并不是所有TGF/BMP通路中靶基因都具有典型的SBE结构，一些靶基因只是在一定程度上可以通过类似序列与MH1结构域相结合。通过X线空间结构分析发现，在5’-GTCT-3’结构中的第二位碱基T并不参与MH1结构域结合，因此，其他碱基替代T[16]。在一些基因启动子区，Smad蛋白复合物识别GC富含区，可以和启动子区GCCGnCGC序列相结合。位于Smad6基因启动子区的BMP反应元件（BMP-responsive element， BRE）中存在4个GC富含模体，且互相重叠，因此可以和GCCGnCGC序列结合，但是，并非Smad1/Smad5/Smad8结合在GC富含模体上，而是Smad2/Smad3与SBE相结合，GC富含模体具有“Smad1结合元件”的功能。SBE和GC富含模体同时参加才能促使Smad1-Smad4复合物和Smad3-Smad4复合物连接在Id1基因启动子区[18]。

3.2 Smad蛋白作用 结合于靶基因启动子特定区域的Smad蛋白转录复合物调节转录活性是通过直接招募转录合作激活因子或抑制因子而得以实现的[19]。除此之外，还存在另外一些调节方式，如Smad蛋白与DNA结合因子合作调节自身基因的表达和Smad蛋白直接与激活因子或者抑制因子作用等等[20]。

转录激活能力需借助与异源Gal4 DNA结合结构域（Gal4 DNA-binding domain， GBD）连接Smad1和Smad4蛋白MH2结构域。融合有GBD的全长Smad1蛋白并不能激活转录，但是由于BMP信号通路激活后作用于内源性Smad蛋白，其进入细胞核与融合的Smad蛋白相作用，却往往能够产生对靶基因强大的转录活性[20]。

Smad蛋白可以通过广泛地与辅助激活因子相互作用，将各种激活信号进行整合。白细胞抑制因子 （leukemia inhibitory factor， LIF）通过与BMP2协作诱导星形胶质细胞分化过程，刺激结合于它们信号通路下游P300不同部位的STAT3和Smad1，于整合信号后诱导胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein）基因启动子激活来获得实现[21]。

Smad蛋白并不仅仅具有转录激活作用，其在某种特定条件下还可以发挥转录抑制作用，例如，Smad蛋白调节的基因转录抑制作用于TGF信号通路对c-Myc基因的调节过程中[22]，这种抑制作用几乎出现在所有的细胞类型中，其发生是通过E2F4或E2F5与DP1形成的异源二聚体与Smad3、Smad4组成的复合物，连接于c-Myc基因TIE上，从而实现抑制DNA的转录目的。

3.3 选择靶基因 在与不同的DNA结合因子结合后，被激活的RSmad-Smad4复合物能够高亲和力和选择性的连接到靶基因启动子区。以下4种水平上DNA辅助因子可以调节Smad蛋白复合物结合的特异性：（1）转录作用特异性；（2）细胞类型特异性；（3）通路特异性；（4）靶基因特异性。

倘若靶基因启动子区包含足够的SBE，即使只存在Smad蛋白复合物靶基因也可能被激活，例如Smad7基因启动子区中含有2个重复的SBE，TGF和BMP通路都可以直接激活该基因[19]。

3.4 转录的强制性 早期研究发现，Smad转录因子活性受到几种机制限制，一种是下调转录机制，在TGF通路中的存在一种转录抑制因子——同源结构域蛋白TGIF，它作为辅助抑制因子可以和Smad2蛋白相互作用，从而使其活性减低[15]。此外，其他一些调节蛋白与Smad蛋白本身，或者其辅助激活因子相互作用，能够降低转录活性。

3.5 解除抑制和失活 Smad蛋白抑制转录可以通过抑制转录激活因子的活性来间接实现。Smad蛋白接受TGF信号后，一方面，Smad3蛋白和MyoD的基本螺旋-圈-螺旋（helixloop-helix， bHLH）结构相结合，以防止形成MyoD-E12/47二聚体结合于靶基因E-盒反应元件上，阻止肌源细胞分化；另一方面，通过移除某些靶基因启动子上的转录抑制因子，从而解除对靶基因的抑制作用。Marty T等[23]研究发现，果蝇Dpp信号通路就是通过减低转录抑制因子Brinker对靶基因的抑制来完成对一些基因的调节的。

3.6 基因协同表达 Baldessari 等[24]研究发现，在同一组织中，一组基因的表达是协同完成的，尤其是容易出现在胚胎发育过程中，而基因协同表达在生物学上则具有更为重要的意义，有学者认为，这些参与协同反应的基因可能属于同族基因，因此，能够对相同因子做出反应，但目前其具体机制尚不清楚。在果蝇研究中发现，TGF家族信号通路中，转录复合物需要由辅助因子RSmad-Smad4共同构成，一个BMP4信号协同组由Smad7、bambi和vent2三种基因共同构成，并通过OAZ-Smad1-Smad4复合物和远处vent2基因启动子区BRE相结合，共同实现对BMP4诱导调节过程[15]。

3.7 泛素化调节和乙酰化作用 均典型的泛素化调节蛋白是Smad1和Smad2蛋白，受到TGF信号的积累刺激，磷酸化的Smad2与26S蛋白酶体中的磷酸酶迅速发生相互作用。除此之外，依赖泛素的蛋白酶体进行缓慢地脱磷酸作用亦可发生。不同于Smad2蛋白，Smad1蛋白缺少BMP信号后磷酸化后，被依赖于泛素化E3连接酶Smurf破坏。另外一些Smurf家族成员成员具有相似的结构，可以作用于不同于其他信号传导通路，如哺乳动物Smurf2调节Smad1、Smad2和Smad3，dSmurf调节果蝇胚胎发育。但是，即具备C末端HECT结构域，并有一个N-C2磷脂蛋白和钙结合结构域是所有Smurf家族成员都存在共同点。Yang Q等[25]研究表明，Smad蛋白泛素化在一定条件下受到乙酰化控制，可通过相同赖氨酸残基乙酰化阻止Smurf泛素化实现，但该过程不会造成蛋白亚细胞分布的改变。

3.8 抑制性Smad蛋白 Smad6和Smad7为脊椎动物的抑制性Smad蛋白，相比与R-Smad或Smad4，二者的MH2结构域缺少了C末端调节受体磷酸化位点，Smad6主要抑制BMP通路，而Smad7则抑制TGF/激活素和BMP信号通路，过表达Smad6/Smad7均会对TGF和BMP通路起到抑制作用。

Smad6与Smad4竞争结合R-Smad1，可以通过形成Smad1-Smad6复合物抑制Smad1-Smad4活性复合物的形成。Smad6基因敲除的小鼠表现为BMP信号反应增高，尤其是在心血管系统中，这是由于Smad4在这些组织中表达量较多所致的[26-27]。

Smad7能够直接和R-Smad蛋白竞争，同时具有与TGF和BMP受体结合能力。在果蝇中研究中发现，Smad7对TGF和BMP信号传导进行调节就是通过该种方式。Smad7除了具有竞争性抑制作用外，还能够调节TGF和BMP通路中Smurf遍在蛋白连接酶体系对受体的遍在蛋白化作用。Smurf2连接到Smad7蛋白，是通过将Smurf-Smad7输出到细胞质中，降调节信号传导，进而调节Smad7的遍在蛋白化和降解Smad[26]。

3.9 信号整合的关键 TGF转录因子家族通过Smad信号通路调控细胞的增殖、分化、代谢迁移、定位以及凋亡等，它与其他信号通路正确整合调控，对于保证个体功能正常而言显得尤为重要，Smad蛋白成为信号整合的关键。Smad蛋白家族提供了一个整合输入信号平台结构，它包含连接区、DNA结合辅助因子以及分子表面与这些因子所连接的部分，在这些结构中，以疏水MH2结构域中的走廊结构为最重要的组成部分[28]。Smad蛋白可以通过上述3种元件与多种信号通路进行连接，并将信号整合传递给细胞核内靶基因，实现调控基因表达目的。

综上所述，随着不断深入研究Smad蛋白家族发现，三种不同类型的Smad蛋白之间存在相互协助作用，依赖Smad4和R-Smad组成活性复合物，借助一些辅助因子的帮助，进入细胞核内对靶基因表达予以调控。而抑制性Smad蛋白起到阻止活性复合物形成、确保Smad蛋白功能正常发挥的作用。Smad作为TGF-β通路的胞内信号蛋白，受到多种信号通路的影响，Smad信号通路已成为TGF转录因子信号通路中重要的组成部分，既能够广泛调节多种基因表达，也能够在各个不同信号在胞内整合中发挥作用，实现对于细胞核内靶基因功能的共同调节。

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