复苏促生长因子结构域及其突变体重组蛋白诱导小鼠免疫应答的研究

邱奕 赵善民 师长宏 史皆然

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）所引起的一种慢性传染病，绝大部分以呼吸系统感染为主。据估计全世界约有1／3人口感染了Mtb，其中，10%的人会发展为活动性TB，而大部分以潜伏感染形式存在［1］。疫苗用于传染病的预防可以达到事半功倍的效果，卡介苗（BCG）是目前惟一用于预防TB的疫苗，但其存在保护期短、免疫应答较弱及对潜伏感染者无效等问题，因此急需开发新型疫苗。结核疫苗根据用途可分为两类：一是预防性疫苗，主要应用于新生儿和未感染的正常人群，保护其不被Mtb感染。二是治疗性疫苗，主要应用于己感染Mtb的无症状携带者，使其不发病；或用于已经发病的患者，促进其早日痊愈［2］。

复苏促生长因子（resuscitation-promoting factor，Rpf）功能类似于真核生物的生长因子［3］，由藤黄微球菌（Micrococcus luteus，M．luteus）分泌，可以促进休眠菌复苏和生长。GenBank数据库中查询到34个与Rpf同源性较高的蛋白质信息，在Mtb H37Rv株和牛分枝杆菌基因组中，5个基因与M．luteus菌Rpf蛋白编码基因同源，分别为Rv0867C（Rpf A）、Rv1009C（Rpf B）、Rv1884C（Rpf C）、Rv2389C（RpfD）和Rv2450C（RpfE），推测这些基因编码的蛋白也具有与Rpf相类似的生物学活性——促细菌生长作用［4-5］。这些基因编码蛋白称为Rpf样蛋白。

本实验室前期制备了Rpf蛋白、Rpf结构域蛋白及Rpf结构域突变体蛋白，并对其生物学功能进行了研究。结果发现，原核表达的Rpf蛋白、Rpf结构域蛋白具有复苏休眠菌的功能，而Rpf结构域突变体蛋白则具有拮抗复苏休眠菌的功能［6］。为此，笔者从2011年11月到2012年2月，进一步观察原核表达的Rpf结构域蛋白及Rpf结构域突变体蛋白刺激小鼠产生特异性抗体及IFN-γ／IL-2水平，以评价该系列蛋白作为疫苗的免疫原性及其对感染Mtb小鼠的免疫保护效力，以期为TB新型疫苗的研制提供实验依据［7］。

材料和方法

一、材料和试剂

6～8周龄雄性SPF级BALB／c小鼠70只由第四军医大学实验动物中心提供。表达谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione S-transferase，GST）融合蛋白包涵体的重组质粒PGEX-4T1-Rpfd、PGEX-4T1-Rpfd1、PGEX-4T1-Rpfd2为本实验室前期制备［6］。Mtb的H37Rv株由陕西省结核病防治研究所王瑞惠赠。7H9液体培养基和7H10固体培养基（美国DIFCO公司）。分枝杆菌培养增强剂ADC和OADC（德国Beckton Dickinson公司）。RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）。小鼠IFN-γELISA试剂盒、小鼠IL-2ELISA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）。P0009BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所）。96孔酶标板（杭州维特洁生化技术有限公司）。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

二、方法

1．Rpf结构域蛋白及其突变体蛋白的纯化与鉴定：采用亲和色谱法纯化目的蛋白并用Rpfd的单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）对表达的目的蛋白进行Western-blot鉴定，证实表达的融合蛋白具有生物活性［6］。

2．蛋白浓度测定：根据二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作，以标准品蛋白（5mg／ml胎牛血清蛋白）浓度为纵坐标，标准品A562值为横坐标绘制标准曲线，得出回归方程：y＝789．08x2＋1243．4x-163．75（R2＝0．9951，y代表待测蛋白浓度，x代表待测蛋白A562值），并计算出每种待测蛋白浓度。

3．待测抗原Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白的浓度：1．400mg／ml、2．438mg／ml、3．882mg／ml（图1）。

图1 562nm波长下测定吸光度A值所绘制的标准曲线

4．免疫小鼠：将70只小鼠采用数字表法随机分为5组，每组14只。Rpfd免疫组（A组）、Rpfd1免疫组（A1组）、Rpfd2免疫组（A2组）、BCG免疫组（B组）和生理盐水组（C组）。每只小鼠采用腹部皮下多点注射分别含有50μg蛋白（Rpfd、Rpfd1、Rpfd2）的200μl生理盐水，间隔2周免疫1次，共3次；B组采用腹部皮下多点注射含有BCG 1×105CFU的200μl生理盐水，C组注射200μl生理盐水。末次免疫后4周，采用尾静脉注射的方式，用剂量为1×105CFU的毒株H37Rv攻击各组小鼠。

5．免疫小鼠血清抗体水平检测：（1）3种抗原板的包被和封闭：根据测得的3种蛋白的浓度，用配制好的0．05mol／L碳酸盐包被缓冲液（pH 值为9．6），分别将3种蛋白稀释至终浓度为10μg／ml，包被96孔板所有反应孔，每反应孔0．1ml，4℃过夜。用洗涤液PBST（pH 值为7．4；组分：NaHPO4、KH2PO4、KCl、NaCl、0．5%Tween-20）洗涤3次。用含0．5%BSA的PBS（pH值为7．4）液37℃封闭2h。同上洗涤后，-20℃保存备用。（2）ELISA法检测免疫小鼠体内抗体水平：末次免疫后1周，随机选取每组小鼠7只，采用摘眼球法取外周血500×g 20min离心分离血清。用稀释液（0．1%BSA的PBS，pH值为7．3）将每组血清依次按1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200比例稀释，分别加入3种蛋白包被的抗原板中，每个样本设3个复孔，同时设置稀释液空白对照孔、生理盐水阴性对照孔和BCG阳性对照孔，37℃孵育1h。用PBST洗涤3次，用稀释液将HRP标记的山羊抗小鼠IgG 1∶5000稀释，37℃孵育1h，再次用PBST洗涤3次，加入邻苯二胺（OPD）和过氧化氢（H2O2）底物显色液，37℃显色10～20min。用2mol／L的H2SO4终止反应，测定450nm处的吸光度。取3孔平均值作为每个样本的终结果。

6．免疫小鼠感染Mtb前后血清IFN-γ水平检测：末次免疫后1周、攻毒后1周，每组取7只小鼠的外周血500×g20min离心分离血清，采用夹心ELISA法检测IFN-γ含量。操作步骤按照相应试剂盒说明书进行。

7．免疫小鼠感染 Mtb前后血清IL-2水平检测：末次免疫后1周，攻毒后1周，每组取7只小鼠的外周血500×g20min离心分离血清，采用夹心ELISA法检测IL-2含量。操作步骤按照相应试剂盒说明书进行。

8．统计学处理：采用SPSS 13．0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，经K-S正态性检验确定每组数据均为正态分布（P值均＞0．05），多组的差异性比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用LSD-t法，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．免疫小鼠血清抗体水平检测结果：免疫小鼠血清特异性抗体含量在A、A1、A2、B及C五组之间不完全相同。A、A1、A2三组蛋白免疫组分别与B、C两组比较，血清抗体含量差异有统计意义，具体见表1。

2．免疫小鼠感染Mtb前后血清IFN-γ水平检测结果：感染前后，免疫小鼠血清IFN-γ含量在A、A1、A2、B及C五组之间不完全相同。三组蛋白免疫组分别与B、C两组比较，血清IFN-γ含量差异有统计意义，具体见表2。

3．免疫小鼠感染Mtb前后血清IL-2水平检测结果：感染前后，免疫小鼠血清IL-2含量在A、A1、A2、B及C五组之间不完全相同。三组蛋白免疫组分别与B、C两组比较，血清IL-2含量差异有统计意义，具体见表3。

讨 论

Rpf由M．luteus分泌，在10-12g水平以自分泌和旁分泌形式促进休眠菌的复活和生长。实验证明，M．luteus Rpf蛋白的A42～L118的77个氨基酸残基是高度保守的区域，称为Rpf结构域，该Rpf结构域是Rpf发挥复苏作用的核心，M．luteus Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物学功能。本实验室前期研究发现，100pmol／L的Rpf结构域蛋白刺激Mtb H37Ra休眠菌复苏和生长作用明显，这种作用在加入抗Rpf结构域蛋白的单克隆抗体mAb后被明显抑制［8-9］，说明封闭这种蛋白可以抑制Mtb的增殖。

表1 免疫小鼠血清中抗体含量（A450值，±s）

表1 免疫小鼠血清中抗体含量（A450值，±s）

注 血清稀释倍数为1∶100，试验中对血清做了不同比例稀释，各个比例血清检测结果趋势一致，故选择稀释比例1∶100血清检测结果作为代表；a：与C组比较；b：与B组比较

组别抗原包被A450值 t值 P值 A450值 t值 P值 A450值 t值 P值Rpfd抗原包被 Rpfd1抗原包被 Rpfd2 A组0．652±0．2120．283b 5．701a＞0．05＜0．05 1．030±0．3045．276b 7．544a＜0．05＜0．05 0．542±0．2400．144b 2．775a＞0．05＝0．05 A1组0．990±0．2724．635b 10．973a＜0．05＜0．05 1．368±0．17117．20b 20．962a＜0．05＜0．05 1．055±0．2028．009b 11．908a＜0．05＜0．05 A2组1．470±0．4556．634b 9．963a＜0．05＜0．05 2．766±0．24531．643b 34．113a＜0．05＜0．05 1．605±0．5448．192b 9．744a＜0．05＜0．05 B组 0．631±0．180 0．573±0．004 0．538±0．100 C组 0．284±0．100 0．370±0．033 0．368±0．006 F值0．020 0．003 0．013 4．846 8．722 5．492 P值

表2 小鼠血清IFN-γ（pg／ml）检测结果（±s）

表2 小鼠血清IFN-γ（pg／ml）检测结果（±s）

注 a：与C组比较；b：与B组比较

感染Mtb H37Rv前感染Mtb H37Rv后组别IFN-γ含量 t值 P值 IFN-γ含量 t值 P值A组553．47±132．003．150b 6．625a＜0．05＜0．05 371．65±78．550．099b 3．110a＞0．05＜0．05 A1组484．85±288．931．089b 3．590a＞0．05＜0．05 492．41±211．742．874b 3．680a＜0．05＜0．05 A2组506．54±378．931．094b 3．840a＞0．05＜0．05 543．09±223．073．150b 6．304a＜0．05＜0．05 B组 385．28±129．07 335．36±207．72 C组 262．19±76．89 260．57±95．47 F值11．002 0．002 10．099 P值0．001

表3 小鼠血清IL-2（pg／ml）检测结果（±s）

表3 小鼠血清IL-2（pg／ml）检测结果（±s）

注 a：与C组比较；b：与B组比较

组别感染Mtb H37Rv前 感染Mtb H37Rv后IL-2含量 t值 P值 IL-2含量 t值 P值A组1490．05±215．357．763b 11．122a＜0．05＜0．05 806．81±306．394．627b 4．789a＜0．05＜0．05 A1组1738．91±358．407．903b 10．061a＜0．05＜0．05 1373．22±143．7515．900b 17．711a＜0．05＜0．05 A2组2270．74±193．4016．308b 21．680a＜0．05＜0．05 439．03±25．152．024b 2．368a＞0．05＞0．05 B组 718．70±269．29 335．26±176．81 C组 553．56±196．26 339．24±144．41 F值605．634 0．000 301．236 P值0．000

本实验室前期设计了M．luteus Rpf结构域特异性PCR引物，应用基因点突变技术将M．luteus Rpf基因序列中的第54位谷氨酸（gag）分别突变为赖氨酸（aag）和丙氨酸（gcg）得到 Rpfd1、Rpfd2突变体。研究表明：5μg／ml的Rpf结构域蛋白和Rpf蛋白均可刺激耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，M．S）生长，该结构域突变体 Rpfd1、Rpfd2对于 M．S 的促生长作用不明显［6］，推测Rpfd1、Rpfd2既可去除复苏休眠Mtb的功能，又能保留诱导机体产生特异性抗体封闭Mtb 5种Rpf样蛋白，从而抑制了Mtb的复苏及生长。

目前研究表明，机体抗结核免疫由体液免疫及细胞免疫构成，在Mtb潜伏感染状态下，体液免疫发挥的作用机制不清。机体内休眠Mtb分泌的Rpf样蛋白刺激机体免疫能力作用很弱，不足以形成抗体。因此，在Mtb潜伏感染状态下，无相应抗体抑制Rpf样蛋白对休眠Mtb的促复苏作用，笔者推测当外源性活跃的Mtb进入机体后，产生的Rpf样蛋白量急剧增多，可唤醒机体内潜伏感染的休眠Mtb，促使休眠Mtb复苏，从而导致TB的发生或是复发。BCG对成人 Mtb保护作用不强，可能因BCG产生抗Rpf样蛋白抗体数量有限，如果能让机体产生及保持比BCG刺激所产生的更高浓度抗Rpf样蛋白的抗体，就有可能封闭无论是外源的、还是自分泌的Rpf样蛋白的功能，从而达到抑制休眠Mtb复苏的作用。

本实验结果表明，Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白均具有很好的免疫原性，能在小鼠体内产生高效价的抗Rpfd特异性抗体，且3种抗原刺激产生的抗体效价显著高于BCG免疫组。其中A组产生的抗体水平最高，提示其启动感染宿主体液免疫能力优于BCG。使用Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白作为抗原，均能被3种抗体识别，且亲合程度趋于一致，说明Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白产生的特异性抗体同Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白之间存在交叉免疫反应，提示该3种蛋白产生的特异性抗体有可能同时封闭Mtb的5种Rpf样蛋白，从而达到抑制休眠Mtb复苏和生长的作用。研究中发现，A组在Rpfd1蛋白作为抗原所产生抗体A450值水平高于B组，在Rpfd、Rpfd2蛋白作为抗原时产生的抗体A450值水平不高于B组，与预期设想不一致，分析可能在小鼠免疫过程中将皮下免疫误注入腹腔，至免疫效能降低所致。

Mtb是胞内寄生菌，特异性免疫以T细胞介导的细胞免疫为主［10-11］。IFN-γ是宿主抵御细胞内Mtb具有代表性的Th1型细胞因子，是机体抵抗Mtb感染重要的细胞因子。IFN-γ基因敲除的小鼠对Mtb的感染高度易感，常规剂量BCG免疫即可导致其死亡［12］。IL-2能促进结核抗原特异性T细胞克隆的增殖活化，促使T细胞分泌IFN-γ，活化NK细胞和巨噬细胞，增强巨噬细胞杀灭Mtb的能力［13］。IL-2或IFN-γ联合抗结核药物治疗难治性肺结核或耐多药结核病，可促使症状改善，痰菌阴转，病灶吸收［14-15］。笔者用原核表达的Rpf结构域蛋白及其突变体蛋白免疫小鼠，分别观察了同源加强免疫后和H37Rv毒株攻击后，机体分泌IFN-γ和IL-2的能力，从细胞免疫应答方面评价Rpf结构域蛋白及其突变体蛋白作为疫苗对感染Mtb小鼠的免疫保护效力。

本实验研究发现，感染前A组小鼠产生的IFN-γ水平高于B组（P＜0．05）和C组（P＜0．05）；感染后A1组、A2组小鼠产生的IFN-γ水平高于B组（P＜0．05）和 C组（P＜0．05）。笔者推测 H37Rv攻击小鼠后，Rpfd发挥其促细菌生长作用，使小鼠体内Mtb大量生长，巨噬细胞吞噬大量Mtb后，崩解死亡致使IFN-γ含量明显下降；而Rpfd1、Rpfd2无促细菌生长作用，巨噬细胞吞噬Mtb后，未达到细菌负荷过载，巨噬细胞杀灭Mtb，同时促进IFN-γ分泌，故IFN-γ量增加。Rpfd、Rpfd1、Rpfd2免疫小鼠后，刺激小鼠产生IL-2水平明显升高，高于B组；Mtb攻击免疫小鼠后，三组蛋白免疫组小鼠血清中IL-2检测量均有下降，A2组IL-2下降尤为明显，推测机体在抵抗Mtb感染中，IL-2起到十分关键的作用，大量消耗IL-2所致，这与Mtb患者IL-2产生量较正常人减少，重型患者尤为明显的临床现象十分吻合。

免疫佐剂是一类非特异性免疫增强剂，与抗原物质合并使用时能增强抗原物质免疫原性，增强机体免疫应答。研究显示，免疫佐剂在以体液免疫为主的疾病治疗中取得了肯定的效果。也有少数报道免疫佐剂可增强结核病的治疗效果。实际上，在以细胞免疫为主的疾病中，免疫佐剂的免疫增强效果不及其对炎症反应的增强效果［16］，故本实验设计中未加入免疫佐剂。

以上结果表明，Rpf结构域蛋白及其突变体蛋白同时具有启动宿主体液免疫功能及增强宿主细胞免疫功能的双重作用，可能起到预防Mtb感染的作用，从而保护新生儿和未感染Mtb的正常人群；并且起到治疗作用，使己感染Mtb的无症状携带者不发病，或用于已经发病的患者，促进其早日痊愈。在下一步实验中将设计构建 Mtb Rpf样蛋白结构域突变体，并建立小鼠潜伏感染模型，观察其对休眠Mtb复苏的抑制效果，以期为TB的防治提供更直接的理论和实践依据。

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