PDGF－A和MVD在大肠癌中的表达及预后意义

骆礼波，程家平，杨伟明，石 磊，贺新媛，杨雪峰，刘 勤，苏晓玥，任 宇 (.遵义医学院附属医院甲状腺乳腺外科，贵州 遵义 563003;.遵义医学院附属医院胃肠外科，贵州 遵义 563003)

大肠癌是常见消化道恶性肿瘤，影响患者预后是肿瘤的侵袭和转移能力。早在1971年，Folkman等［1］就提出“肿瘤血管生长因子理论”，他们认为:肿瘤生长及转移依赖于新生血管生成。在促进肿瘤血管生长诸多因子中，有VEGF家族，FGF家族及PDGF家族等，PDGF家族是研究相对较早因子之一。早在1973年，Ross［2］在人血清中发现了PDGF，其分子量为27～31 KD，为由A、B两链组成的碱性蛋白质，因来源血小板而得名。PDGF家族成员包括PDGF－A，PDGF－B，PDGF－C，PDGF－D。多项研究表明，PDGF－A是该家族中研究最多，相对较成熟的肿瘤新生血管诱发因子。Sharma等［3］指出MVD最有价值的是能预测实体肿瘤的侵袭和转移，并与实体肿瘤各种预后因素有关，是预测全身和局部复发及无病生存的重要指标。Katano等［4］报道:PDGF－A与胃癌关系密切，可能在胃癌预后中起重要作用。越来越多研究表明，PDGFA在多种肿瘤中过度表达，与肿瘤侵袭和转移有关［5］，参与成纤维细胞，内皮细胞和平滑肌细胞等增殖，具有趋化性和促有丝分裂性能，可以促进结缔组织并产生细胞外基质蛋白(ECM)及直接或间接导致肿瘤血管生成。闫巍中等［6］研究报道:血管生成素(angiogenin)中的促血管生成素－1(Ang－1)，促血管生成素－2(Ang－2)及促血管生成素受体－2(Tie－2)表达程度与大肠癌的进展期呈正相关，而运用PDGF－A和MVD对大肠癌患者生存期进行评估，国内外文献鲜于报道。本研究运用免疫组化方法(Envision法)探讨PDGF－A和MVD在大肠癌组织中表达与患者生存预后关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料:收集我院胃肠外科1997年3月～2007年2月生存期≥5年(甲组)及≤3年(乙组)大肠癌患者组织标本各30例。所有标本均经病理证实为大肠癌组织，全部患者均为第一次手术，术前均未接受任何放疗、化疗和其他治疗。甲组:男14例，女16例;年龄30～79岁，平均50.1岁。Dukes分期，A+B期18例，C+D期14例;有淋巴结转移11例，无淋巴结转移者19例。乙组:男18例，女12例;年龄27～73岁，平均56.1岁;Dukes分期，A+B期12例，C+D期16例;有淋巴结转移16例，无淋巴结转移者14例。60例中，29例未突破肌层，其余31例全部浸润至浆膜及浆膜层外。分化程度方面，高分化腺癌28例、中低分化腺癌及黏液腺癌32例。

1.2 免疫组化试剂，仪器及其他耗材:特异性一抗是兔抗人PDGF－A多克隆抗体(编号bs－0196R，工作液浓度1:100)，购于北京博奥森公司;鼠抗人CD34单克隆抗体(工作液浓度1:100)购于福州迈新公司。二抗试剂盒(编号GK500705，包括Envision二抗检测即用型，DAB显色试剂)购于美国基因公司。经多聚赖氨酸处理的防脱玻片，PBS缓冲液，EDTA抗原修复液及一抗稀释液均购于北京中杉金桥公司。另二甲苯，乙醇，双氧水，苏木素，微波炉均为实验室自备。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化染色:石蜡组织切割成4 μm厚切片，均经HE染色再次确认原始组织学诊断后行免疫组化染色。二甲苯梯度脱蜡两次，每次10 min，乙醇梯度水化，3%双氧水浸泡10 min去除内源性过氧化物酶，EDTA微波修复抗原(CD34，PDGF－A均为10 min)，自然冷却后PBS液冲洗3次，每次5分钟，加一抗后4℃过夜。第二次给予PBS液冲洗3次，每次5分钟。滴加二抗，室温30 min后再次PBS液冲洗3次，每次5分钟。DAB显色，苏木素复染细胞核，乙醇梯度脱水，透明，中性树胶封片。以PDGF－A，CD34强阳性片为阳性对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.3.2 结果判定

1.3.2.1 PDGF－A判断:PDGF－A主要表达于肿瘤细胞的细胞浆或胞膜上，在癌旁的间质中可见少量表达，以胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。每张切片选取10个不同部位，400倍视野下计数，按阳性细胞数占总细胞数的比例和染色深度进行评分和分级。染色强度分级:无着色为0分，淡棕黄色为1分，棕黄色及更深颜色为2分;阳性细胞分级:阳性细胞数≤50%为0分，＞50% ～75%为1分，＞75%为2分。两项得分相加，结果2分为阳性表达。

1.3.2.2 MVD判断:作为标记微血管最主要的CD34，以血管内皮细胞胞膜染成棕黄色或棕褐色为阳性表达，MVD计数参照Maeda等报道方法［7］，计数5个高倍镜视野(×200)内微血管数，取其平均数为该组织MVD值。以上免疫组化染色结果均由具备多年病理诊断经验的技术人员2人采用双盲法参与判定。

1.3.3 统计学处理:实验结果采用SPSS17.0统计学软件进行分析。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，采用Spearman等级相关进行相关性分析。检验水准α=0.05，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDGF－A，MVD表达与性别，年龄，分化程度及病理分型关系:免疫组化显示:大肠癌组织中PDGF－A主要表达于肿瘤细胞的胞浆或胞膜内，以胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒阳性染色为主，而尤其以癌巢边缘着色明显，表明PDGF－A表达最明显部位位于肿瘤细胞浸润前缘，见图1，肿瘤组织间质间可见少量表达。CD34是目前运用最多，较为成熟的标记微血管蛋白，以血管内皮细胞胞膜染成棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达。主要表达于肿瘤间质区，微血管数量以肿瘤周边相对较多，见图 2。60例中，PDGF－A阳性表达率为53.3%(32/60)，MVD值为20～76，平均为41.05。两者与性别、年龄、TNM分期、浸润深度无关。见表1。

图1 A大肠癌癌巢胞质内PDGF－A的表达(×400)

表1 大肠癌组织中PDGF－A.MVD的表达与临床病理参数关系

图2 A大肠癌癌巢间质内CD34的表达(×100)B大肠癌癌巢边缘上CD34的表达(×400)

2.2 PDGF－A，MVD表达与病理学分级，淋巴结转移间关系:PDGF－A，MVD在肿瘤细胞病理学分级的中低分化型，有淋巴结转移的表达分别为65.6%(21/32)，70.4%(19/27);(45.72±11.87)，(44.37±12.50)均显著高于高分化型，无淋巴结转移的 39.3%(11/28)，39.4%(13/33);(35.71±9.37)，(38.33±10.65)差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 PDGF－A，MVD表达与生存期，患者预后关系:生存期≥5年大肠癌患者(甲组)与≤3年大肠癌患者(乙组)PDGFA，MVD表达分别为36.7%(11/30)，70.0%(21/30);(37.70±10.32)，(44.40±12.42)。差异较为显著，有统计学意义(＜0.05)。研究发现，PDGF－A着色及阳性细胞数表达越多切片，相对应 MVD值越高。两者呈正相关(r=0.965，P＜0.05)。

3 讨论

Folkman指出:血管形成可根据肿瘤发展分为血管前期和血管期。在血管前期，实体瘤缓慢生长或不生长，多数直径不超过1mm，很少向周围浸润，几乎不发生转移［8］。一旦进入血管期，肿瘤必须要建立自身的血管系统以获得充足的氧和营养成分，生长速度随之加快，瘤体向周围侵袭。由于新生肿瘤血管内皮细胞不完整或基底膜中断、缺如、脱落，肿瘤细胞容易进入血液循环，引起肿瘤侵袭，转移。可以说，肿瘤血管的新生在肿瘤良恶性间，恶性肿瘤分期及淋巴结转移间扮演了极其重要的角色。多项研究显示，血管的新生需要多种诱发因子，如细胞因子，生长因子，ECM复合物等［9］。在这些血管生长因子中，PDGF与VEGF，FGF有相似的促血管生成作用。MVD是肿瘤微血管形成程度的标志和肿瘤的生物学特征，是评价肿瘤血管生成状态的最佳指标。已有多项研究表明，在乳腺癌、肾癌、头颈部肿瘤等的MVD高低与肿瘤复发和转移密切相关。

PDGF促进血管生成的机制可能为:①肿瘤细胞和血管内皮细胞都表达PDGF受体，因此，PDGF在肿瘤表达上可起自分泌或旁分泌作用。②通过间接途径即激活邻近组织细胞或平滑肌细胞释放VEGF，FGF等生长因子促进血管生成。③参与并促进恶性肿瘤间质反应，PDGF与其受体结合可提高ECM降解及促进肿瘤侵袭，转移过程。在肿瘤浸润转移过程中发挥重要作用。本试验表明，生存期≥5年大肠癌患者在淋巴结转移方面，其PDGF－A阳性率，MVD数值与≤3年大肠癌患者比较，差异有统计学意义。PDGF－A对大肠癌的生长和转移可能有促进作用，PDGF－A和MVD可以作为判断大肠癌患者预后的重要参考指标。但其病理学分级间的显著差异与辛林等［10］报道PDGF－A与病理学分级无关，而与Dukes分期呈正相关不相符合。PDGF－A与病理学分级相关原因不清楚，国内曾有在口腔鳞状细胞癌中PDGF－A与病理学分级有密切联系的报道。关于在大肠癌中这两者之间关系报道甚少，需要深入探讨研究。

［1］Weidner N.Tumor angiogenesis:review of current applications in tumor prognostication［J］.Sem in Diag Pathol，1993，10(4):302.

［2］Ross R.Platelet derived growth factor［J］.Annu Rnnu Rev Med ，1987，38:71.

［3］Sharma S，Sharma MC，Sarkar C，et al.Morphology of angiogenesis in human cancer:a conceptual overview.histoprgnostic perspective and significance of neoangiogenesis［J］.Histopathology，2005，46(5):481.

［4］Katano M.，Nakamura M，Fujimoto K，et al.Prognostic value of platelet－derived growth factor－A in gastric carcinoma［J］.Ann Surg，1998，227(3):365.

［5］Mah Becherd MCM ，Ceraline J，Deplaneque G，et al.Anti－angiogenic effects of the thieno pyridino SR 25989 invitro and in vivo in a murine pulmonary metastasis model［J］.Br J Cancer，2002，86(5):803.

［6］闫巍中，温春阳.大肠癌组织中Ang－1，Ang－2及受体Tie－2的表达及意义.吉林医学，2011，12(13):2501.

［7］Maeda K，Chung YS，Ogawa Y，et al.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma［J］.Cancer，1996，77(5):858.

［8］Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis denpendent［J］.J Natl Cancer Inst，1990，82(1):4.

［9］Cross MJ，Claesson－Welsh L.FGF and VEGF function in angiogenesis:signaling pathways.biological responses and therapeutic inhibition［J］.Trends Pharmacol sci，2001，22(4):201.

［10］辛 林，彭洪云.大肠癌PDGF和VEGF基因mRNA表达研究［J］.大肠肛门病外科杂志，2002，18(1):24.