糖脉通对糖尿病模型大鼠血管组织肥胖抑制素mRNA表达的影响※

蔡欣蕊 钱卫斌 钱秋海 郭春芳 姜群群

(山东中医药大学第一临床医学院2012级博士研究生，山东 济南 250014)

实验研究

糖脉通对糖尿病模型大鼠血管组织肥胖抑制素mRNA表达的影响※

蔡欣蕊 钱卫斌1钱秋海△郭春芳2姜群群3

(山东中医药大学第一临床医学院2012级博士研究生，山东 济南 250014)

【摘 要】目的观察中药组方糖脉通对糖尿病模型大鼠血管组织肥胖抑制素(Obestatin) mRNA表达的影响并探讨其机制。方法将60只雄性SD大鼠用链脲佐菌素(STZ)联合高脂饮食制造糖尿病模型大鼠，选取40只随机分为模型对照组、西药对照组、糖脉通小剂量组、糖脉通大剂量组4组，每组各10只；另取10只正常大鼠为空白对照组。模型对照组以0.9%氯化钠注射液10 mL/kg灌胃给药；糖脉通小剂量组在格列齐特20 mg/kg的基础上，以生药浓度为2 g/mL糖脉通水煎剂10 mL/kg灌胃给药；糖脉通大剂量组在格列齐特20 mg/kg的基础上，以生药浓度为4 g/mL糖脉通水煎剂10 mL/kg灌胃给药；西药对照组在格列齐特20 mg/kg的基础上，以浓度为1.8 mg/mL的西洛他唑混悬液10 mL/kg灌胃给药；空白对照组以等容积蒸馏水灌胃。除空白对照组外均给予高糖高脂饲料。药物干预12周后，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组大鼠血管组织Obestatin mRNA的表达。结果模型对照组、西药对照组及糖脉通小剂量组大鼠血管组织中Obestatin mRNA表达水平较空白对照组明显升高(P<0.05)；糖脉通大、小剂量组及西药对照组血管组织中Obestatin mRNA表达较模型对照组减少(P<0.05)，且糖脉通大、小剂量组效果优于西药对照组(P<0.05)。结论糖脉通可能通过降低Obestatin mRNA在模型大鼠血管组织中的异常表达，对血管功能起到保护作用。

【关键词】糖脉通；糖尿病血管病变；高脂血症；疾病模型，动物；胃促生长素；RNA，信使；逆转录聚合酶链反应

糖尿病下肢动脉血管病变(lower-extremity arterial disease，LEAD)是指糖尿病患者出现下肢动脉粥样硬化及微血管病变为主要病理改变，以肢端疼痛、间歇性跛行、溃疡、坏疽为主要临床表现，是糖尿病最常见的慢性并发症之一。肥胖抑制素(Obestatin)是从大鼠胃组织中分离的一种生长素(Ghrelin)相关肽，可以结合孤儿G蛋白偶联受体GPR39，产生与Ghrelin相反的作用，具有非常广泛的生物学功能。本研究通过观察糖脉通对糖尿病模型大鼠血管组织Obestatin mRNA表达水平的影响，进一步从实验方面来验证其疗效，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠50只，体质量(200±20) g，由山东中医药大学实验动物中心提供[动物合格证号：SCXR(鲁)2009015]。普通动物饲料由山东省实验动物中心提供，高糖高脂饲料(清洁级)由北京科澳协力饲料有限公司提供(配方：10.0%猪油，20.0%蔗糖，10.0%蛋黄粉，0.5%胆酸钠和59.5%常规饲料)。

1.1.2 药物及试剂 糖脉通药物组成：黄芪30 g，黄精30 g，桑枝15 g，地龙9 g，水蛭15 g，大血藤15 g，土茯苓30 g。实验时制成糖脉通浓缩煎剂，分别为2、4 g/mL。西洛他唑片(100 mg/片，浙江大冢制药有限公司，国药准字H10960014)，格列齐特片(80 mg/片，南京瑞尔医药有限公司，国药准字H20003361)。链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)：美国Sigma公司生产，北京博爱港商贸有限公司提供。超纯RNA提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit，Transgene PCR Mix，日本TOYOBO公司；DL2000 DNA Marker，日本TAKARA公司；氯仿分析纯，异丙醇，无水乙醇，焦碳酸二乙酯(DEPC)水等。

1.1.3 实验仪器 普通高速离心机(5415D型，Eppendorf公司)；PCR仪(PTC-200 Peltier Thermal Cycler，美国PE公司)；Alpha Imager TM 2200 凝胶成像系统(Alpha Innotech 公司)；Bio Rad 电泳仪及电泳槽(北京东方恒伟科技开发公司)；美国强生稳豪全自动血糖仪；移液器(Gilson 产品)，Axygen无RNA酶枪头及eppendorf管等。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法 取健康SD雄性大鼠50只，以普通动物饲料适应性喂养3 d后，改用高糖高脂饲料喂养6周。最后一次喂食后禁食12 h，断尾取静脉血测空腹血糖。然后用0.1 mmol/L无菌枸橼酸钠缓冲液(4 ℃，pH值=4.2)配置浓度为2%的STZ溶液，按30 mg/kg左下腹腔单次注射STZ，制造糖尿病(DM)模型。72 h后断尾取静脉血测空腹血糖，选空腹血糖≥16.7 mmol/L的动物作为STZ糖尿病大鼠模型，选取40只进入实验。

1.2.2 分组及给药 将40只成模大鼠随机分成4组，每组10只。①模型对照组：0.9%氯化钠注射液10 mL/kg灌胃；②糖脉通小剂量组：在用格列齐特20 mg/kg的基础上，给予生药浓度为2 g/mL糖脉通水煎剂10 mL/kg灌胃；③糖脉通大剂量组：在用格列齐特20 mg/kg的基础上，给予生药浓度为4 g/mL糖脉通水煎剂10 mL/kg灌胃；④西药对照组：在用格列齐特20 mg/kg的基础上，给予浓度为1.8 mg/mL的西洛他唑混悬液10 mL/kg灌胃。另取10只正常大鼠，普通饲料喂养，腹腔注射等量无菌枸橼酸钠缓冲液，血糖均在4.7～7.3 mmol/L，选为空白对照组，给予等容积蒸馏水灌胃。室温18～20 ℃，相对湿度69%，12 h交替照明，大鼠自由饮水，除空白对照组外其余各组大鼠继续给予高糖高脂饲料喂养，连续给药观察12周。

1.2.3 组织标本的采集 给药观察12周后，断尾取静脉血检测各组动物空腹血糖(取血前禁食8 h)。然后用戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，开腹于脊柱旁剖离腹主动脉并截取，用0.9%氯化钠注射液冲洗后，放入-80 ℃冰箱备用。

1.2.4 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转化生长因子-β1(TGF-β1)。

1.2.4.1 总RNA提取 按超纯RNA提取试剂盒(CW0581)说明书进行。100 mg组织标本经液氮研磨，加入1 mL Buffer RLT，室温放置5 min，让组织完全裂解。加200 μL氯仿，充分剧烈震荡 15 s，室温放置2～3 min，12 000 r/min离心15 min。将上清液转移到新的Eppendorf管内，加等量的无水乙醇，混匀，将混合物加到离心柱上，12 000 r/min离心30 s，加异丙醇 1 700 μL，分别12 000 r/min离心30 s，加异丙醇2 500 μL 2次，12 000 r/min离心30 s，14 000 r/min离心2 min，加预热的DEPC水50 μL，室温放置2～3 min，12 000 r/min离心30 s，收集RNA。

1.2.4.2 RT-PCR 反应检测Obestatin mRNA表达

逆转录：5×BT buffer 2 μL

Primer Mix 0.5 μL

Enzyme Mix 0.5 μL

RNA 1 μg

DEPC-H2O 补足10 μL

逆转录程序：37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，

PCR： 2×PCR mix 10 μL

10 μmol/L Obestatin上游引物 0.4 μL

10 μmol/L Obestatin下游引物 0.4 μL

10 μmol/L β-actin上游引物 0.2 μL

10 μmol/L β-actin下游引物 0.2 μL

RT产物 4 μL

DEPC H2O 补足20 μL

PCR程序：94 ℃3 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃5 min。

大鼠β-actin上游引物：5’-GAG GGA AAT CGT GCG TGA C-3’，

大鼠β-actin下游引物：5’-GGA CTC ATC GTA CTC CTG CTT G-3，

扩增产物：481 bp

大鼠-Obestatin上游引物：5’-ATG GTG TCT TCA GCG ACT ATC T-3’

大鼠-Obestatin下游引物：5’-CTC TGC TGG GCT TTC TGG-3’

扩增产物：113 bp

1.2.4.3 电泳及数据分析 1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染料。Alpha imager观察电泳条带存入图象，β-actin的产物为481 bp，Obestatin的产物为113 bp。以系统的SPOT DENSITY 软件分别测量内参照和Obestatin基因扩增条带的密度，以Obestatin条带的密度与内参照管家基因β-actin的密度比值代表基因表达的相对水平。

2 结 果

糖脉通对模型大鼠血管组织Obestatin mRNA表达的影响见表1。

表1 糖脉通对模型大鼠血管组织Obestatin mRNA表达的影响 ±s

与空白对照组比较，*P<0.05;与模型对照组比较，△P<0.05 ;与西药对照组比较，#P<0.05

由表1可见，模型对照组、西药对照组及糖脉通小剂量组大鼠血管组织中Obestatin mRNA表达水平较空白对照组明显升高(P<0.05)；糖脉通大、小剂量组及西药对照组大鼠血管组织中Obestatin mRNA表达较模型对照组减少(P<0.05)，且糖脉通大、小剂量组效果优于西药对照组(P<0.05)。(见封3，图1)。

3 讨 论

LEAD属于糖尿病动脉硬化性疾病，又称周围血管病变，是糖尿病最常见的慢性血管并发症之一。血管内皮细胞是血管的基本结构，参与血管内外物质交换和血管新生等，具有重要生理作用。血管内皮细胞损伤常常是动脉粥样硬化(AS)、糖尿病血管并发症和高血压等疾病的始动环节，并贯穿疾病发展的整个过程[1]。因此，对血管内皮细胞的保护已成为治疗糖尿病大血管病变研究的重要方向。

某些生长因子对血管内皮细胞的正常代谢及维持血管的基本结构起着重要的作用。Ghrelin是生长激素促分泌激素受体的内源性配体，它是由28个氨基酸残基构成的小分子短肽[2]，传统认为其对食欲及糖、脂的合成代谢有重要的作用。近来有研究表明，Ghrelin还可降低血管的炎症反应，通过抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的细胞核因子(NF)-κB的激活来抑制促炎症的趋化因子白细胞介素-8(IL-8)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达，从而抑制早期AS的发生[3]。Obestatin是2005年从大鼠胃组织中分离的一种Ghrelin相关肽，它可以结合孤儿G蛋白偶联受体GPR39，产生与Ghrelin相反的作用[4]。Obestatin亦具有非常广泛的生物学功能，除负向调节摄食和胃肠运动外[4]，也可作用于胰腺胰岛组织抑制胰岛素、胰多肽、生长抑素等的分泌[5]。另有研究表明Obestatin与各种糖、脂代谢因素密切相关[6]。鉴于对心血管尤其是血管内皮细胞的保护作用，Ghrelin与Obestatin已逐渐成为糖尿病大血管病变的研究热点。

本实验通过观察糖脉通对糖尿病模型大鼠血管组织Obestatin mRNA表达的影响。结果显示模型大鼠血管内皮细胞中Obestatin mRNA的表达明显升高，而糖脉通可显著抑制Obestatin mRNA在血管内皮的异常表达，效果优于西药对照组。提示糖脉通可能通过抑制Obestatin mRNA在血管内皮的异常表达起到保护血管内皮、延缓血管病变病程的作用。

[1] Cohen G，Riahi Y，Alpert E，et al.The roles of hyperglycaemia and oxidative stress in the rise and collapse of the natural protective mechanism against vascular endothelial cell dysfunction in diabetes[J].Arch Physiol Biochem，2007，113(4-5)：259-267.

[2] Kojima M，Kangawa K.Ghrelin，an orexigenic signaling molecule from the gastrointestinal tract[J].Curr Opin Pharmacol，2002，2(6)：665-668.

[3] Li WG，Gavrila D，Liu X，et al.Ghrelin inhibits proinflammatory responses and nuclear factor-κB activation in human endothelial cells[J].Circulation，2004，109(18)：2221-2226.

[4] Zhang JV，Ren PG，Avsian-Kretchrner O，et al.Obestatin，a peptide encoded by the ghrelin gene，opposes ghrelin’s effects on food intake[J].Science，2005，310(5750)：996-999.

[5] Ataka K，Inui A，Asakawa A，et al.Obestatin inhibits motor activity in the antrum and duodenum in the fed state of conscious rats[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，294(5)：G1210-G1218.

[6] 徐海蓉，郑兴，郭志福.单纯性肥胖症患者外周血ghrelin、obestatin的水平变化及其临床意义[J].心脏杂志，2009，(1)：95-98.

EffectofTangmaitongonmRNAexpressionofObestatinininthevasculartissueofdiabeticratsmodel

CAIXinrui*,QIANWeibin,QIANQiuhai,etal.

*2012Doctor-postgraduate,TheFirstClinicalMedicalCollegeofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicineShandong,Jinan250014

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect and mechanisms of Tangmaitong on mRNA expression of Obestatin in the vascular tissue of diabetic rat’s model.Method Rat diabetic model were made with STZ and high-quality and high-carbohydrate diet.40 diabetic model rats were randomly divided into four groups,model group,western medicine group,high-and low-dose Tangmaitong group.10 normal rats were as control group.Model group received 0.9% NaCl solution,high-and low-dose Tangmaitong groups received 10mL/kg(2 g/mL,4 g/mL crude drug) on the basis of Gliclazide,20mg.kg.Rat in western medicine group received 10 mL/kg(Cilostazol suspension 1.8 mg/mL) on the basis of Gliclazide,20mg.kg.Control group received equal volume of distilled water.After 12 weeks of drug intervention,rats were killed,the vascular were removed and the mRNA expression of Obestatin in the vascular was observed by the method of RT-PCR.ResultsThe mRNA expression of Obestatin was significantly increased,and Tangmai-tong could lower the mRNA expression of Obestatin in the vascular in a dose-dependent manner.The decrease of the mRNA expression of Obestatin in high-and low-dose Tangmaitong group was superior to that in western medicine group(P<0.05).ConclusionTangmaitong can play a protective effect on vascular function by reducing the abnormal expression of Obestatin in the vascular tissue of diabetic rat’s model,and deserves further research.

【Key words】Tangmaitong; Diabetic angiopathies; Hyperlipemia; Disease model; Animal; Ghrelin; RNA; Messenger; RT-PCR

【中图分类号】R587.230.531；R589.210.531；R342.22

A

1002-2619(2013)12-1868-03

※ 项目来源：山东省科学技术发展计划项目(编号：2010GSF10242)；山东省中医药科技发展计划项目(编号：2009Z004)

山东中医药大学附属医院内分泌科，山东 济南 250011

1 日本鸟取大学医学部，日本 鸟取 683-8503

2 山东省禹城市人民医院内分泌科，山东 禹城 251200

3 中国人民解放军第一○七医院内分泌科，山东 烟台 264000

蔡欣蕊(1985—)，女，博士研究生在读，硕士。研究方向：中医内科学专业。

2013-06-17)