半滑舌鳎苗种体外挂牌标志技术研究

柳学周, 徐永江, 陈学周, 刘之亮,2, 王妍妍, 李春广,2

(1. 中国水产科学研究院 黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 山东 青岛 266071;2.中国水产科学研究院 黄海水产研究所青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室，山东 青岛 266071;3.全国水产技术推广总站，北京 100125)

近年来，随着人类活动的日益频繁和临港工业的快速发展等问题不断出现，导致了环境污染的加剧，致使我国近海海洋生物资源不断衰退，开展人工增殖放流成为修复渔业资源最有效的方式，其中对放流生物的标志技术成为对放流生物进行追踪、回捕和效果评估的重要依据。自19世纪80年代以来，有学者采用标记鱼的方法估算封闭水体中鱼类种群的大小和死亡率，标志放流技术开始慢慢发展起来。在诸多标志方法中，体外标志因易操作、易识别和成本低廉而广为应用，其中T型标志牌为使用较为广泛的一种体外标志[1]，且标志牌一般不易脱落，保持率高，保留时间长，能区分不同的个体，有易被发现及回收简便等优点[2-3]，适宜于长期的标记追踪试验研究。国外开展的海水鱼类体外挂牌标志放流技术研究较多，如金头鲷(Sparusaurata)[4]、鲑鱼(Salmosalar)[5]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[6]、欧洲无须鳕(Merlucciusmerluccius)[7]等。我国自上世纪90年代以来也相继开展了多种鱼类的标志放流技术研究，如大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)[8-9]、牙鲆[10]、鮸鱼(Miichthysmiiuy)[11]的标志放流等，取得了一定的进展，为这些鱼类的大规模增殖放流奠定了基础。目前，尚未见有关海水鱼类T型牌标志放流的报道。

半滑舌鳎(CynoglossussemilaevisGünther)是我国本土重要经济鱼种，目前，其自然资源和渔获量日益减少，加快开展半滑舌鳎增殖放流已成为保护其自然资源的重要途径之一。近年来，我国黄渤海区开展了大规模半滑舌鳎的增殖放流工作，年放流半滑舌鳎苗种数百万尾。为评估半滑舌鳎的放流增殖的效果，2010年以来，笔者开展了半滑舌鳎的体外挂牌标志技术研究，筛选出了适宜半滑舌鳎苗种放流专用的T型标志牌，并确定了适宜的标志方法，为批量化标志放流和增殖效果评估提供了技术依据。

1 材料与方法

1.1 标志牌规格和标志枪

T型标志牌主要包括锚定端、连接线和标志牌3个部分，各部分量度如图1所示，T-A、T-B、T-C和T-D等4种标志牌的规格见表1。标志牌、连接线加锚定端都是聚乙烯材制制作，安全无毒。各种标志牌总重量与标志牌重量与实验鱼体湿重的比值(R)

R=WT/WF×100%

(1)

式中，WT为不同规格标志牌的总重量，WF为实验鱼的体重。4种规格的标志牌与试验鱼体重的比值见表2。

本研究中，以标记后实验鱼暂养期间脱牌率低于10%，存活率高于90%作为评价T型标志牌是否适宜于标志放流的依据。

表1试验用T型标志牌的规格特征Table 1 The size and weight of four kinds of T bar tags used in the present study

表2 标志牌重量占鱼体重量的比值Table 2 The T bar tag weight to fish weight ratio (R) in the present study

图1 标志试验使用的标志牌及规格示意图Fig.1 Type and size schematic of T bar tags used in the present study

1.2 实验鱼及实验设计

2011-07-10本试验在青岛忠海水产有限公司进行。试验用半滑舌鳎苗种为该公司人工培育的健康苗种，苗种色泽正常，大小规则整齐，健康活泼，摄食良好。

选用平均全长5 cm(体重0.8～1.2 g)、8 cm(体重3.2～4.6 g)、12 cm(体重7.2～9.7 g)、16 cm(体重18～22 g)的苗种用于试验,利用4种不同规格的T型标志牌(T-A、T-B、T-C、T-D)进行了挂牌标记。全长5 cm的苗种仅以T-A标志牌标记，其它3个规格的苗种分别以4种标志牌标记。共设置13个试验组，每组使用试验鱼100尾，每个试验组设置一个重复。试验用苗种先在容积为25 m3的水泥池中暂养3 d后用于试验。

试验用鱼的培育条件：水温20～24 ℃、盐度28～30、pH 7.8～8.2、溶解氧5 mg/L以上。暂养期间投喂日本产的日清配合饲料，投喂量为鱼体重的2%～3%，每日清理培育池一次。

1.3 标志操作方法

试验开始前，所有试验鱼提前一天停食。标志操作前，所有实验鱼都以MS-222进行麻醉，麻醉剂量选择的标准是试验鱼入麻时间快，恢复时间短，无不良反应。半滑舌鳎苗种的麻醉剂量参照刘长琳等[12]的结果，全长5～8 cm的苗种设定为50 mg/L，全长12 cm以上苗种设定为80 mg/L。

在挂牌标志时，以专用标志枪进行背部挂牌标记操作。标志枪枪头以70%酒精消毒后使用。挂牌标记的部位选择被标记鱼背鳍基部下方背部肌肉最厚的部位(一般距头部约2 cm处)，标记枪与鱼体呈45°～60°角。标记枪头自鳞下间隙处插入，入肌肉5 mm左右，标志枪枪头不穿透鱼体。标记完成后以手指轻压标志部位轻轻快速抽出标记枪，使得标志牌锚定端留在实验鱼体内。标志后对标志鱼用土霉素(5 mg/L)进行浸泡消毒处理，以防止伤口感染。

图2 T型标志牌对半滑舌鳎的标记效果Fig.2 Real effect of T bar tagged tongue sole

1.4 标志鱼的暂养

挂牌标记完成后，各个组别的试验鱼分别置于500 L的小型玻璃钢水槽内暂养15 d，暂养条件：水温22～24 ℃、盐度28～30、pH 7.8～8.2、溶解氧5 mg/L以上，充气、流水培育，流水量为7～8个流程。暂养期间投喂日本产的日清配合饲料，投喂量为鱼体重的2～3%，每日清池1次。暂养期间，记录每个实验组的死亡率和脱牌率，观察实验鱼的游泳行为和摄食情况。

在室内玻璃钢水槽暂养15 d，将存活下来的实验鱼选择T-A标志的全长12 cm的半滑舌鳎苗种180尾转移到室外池塘(1亩)进行养殖，同时以180尾同等规格的非标记苗种作为对照在室外池塘内共同培育。入池前测量实验鱼的体长和体重，经池塘养殖60 d后出池，记录成活率和脱牌率，随机测量50尾试验鱼的体长、体重等生长情况，以评估体外挂牌标志的效果。池塘养殖期间，养殖水温23～26 ℃，溶解氧7 mg/L以上，养殖池塘每天换水约30%。养殖期间，先投喂活卤虫进行驯化诱导摄食，1周后转为日清牌配合饲料。标志后半滑舌鳎苗种在池塘养殖期间的特异生长率(SGR)

SGR=(eG-1) ×100%

(2)

(3)

式中，W1为起始个体重量，W2为实验结束后个体体重，Δt为实验持续时间。

1.5 挂牌标志放流示范

2011年秋季，在莱州开展半滑舌鳎生产性放流，利用本研究开发的T-A标志牌对平均全长12 cm的半滑舌鳎苗种进行批量标记试验。

1.6 实验结果分析

试验数据均表示为每个试验组两个重复的平均数。在池塘培育的标记鱼和未标记鱼的生长数据表示为Mean ± S.D.，利用单因素方差分析(ANOVA)统计分析体长、体重和存活率等的差异显著性，当P<0.05视为差异显著，反之不显著。统计分析使用SPSS(16.0版本)软件进行。

2 结 果

2.1 挂牌标记对苗种脱牌率、成活率的影响

标记后试验鱼在室内500 L的玻璃刚水槽内流水暂养。在挂牌标记操作后，试验鱼一般静卧于池底不游动，不摄食。全长8 cm的苗种在第4 d开始逐渐摄食，游泳行为正常；全长12 cm的苗种在标记操作2 d后游泳行为正常;在第3 d开始摄食，摄食量随时间推移逐渐与对照组基本一致;全长16 cm的苗种在暂养后第2 d恢复正常游泳行为，并有部分苗种开始摄食，在第3 d摄食正常。

不同规格的T型标志牌对不同规格的半滑舌鳎苗种进行标志后暂养15 d的脱牌率和存活率见表3。平均全长5 cm的苗种：由于鱼体规格过小，本研究仅以T-A标志牌标记，但脱牌率仍高达47%以上，且实验鱼在标记后3 d内全部死亡(结果未在表3列示)。平均全长16 cm的苗种：以T-A和T-B标志牌标记后成活率为100%，未出现脱牌的情况；以T-C和T-D标志牌标记后，脱牌率高于30%，成活率低于18%，T-D标记组全部死亡。对于平均全长12 cm的苗种：以T-A标志牌标记后成活率为100%，未发现脱牌；以T-B标志牌标记后脱牌率为7%，但成活率仅为80%；以T-C和T-D标志牌标记后，脱牌率高于30%，成活率低于18%，T-D标记组全部死亡。平均全长8 cm的苗种：以T-A标志牌标记后成活率为92%，脱牌率为7%；以T-B标志牌标记后脱牌率为20%，但成活率仅为57%；以T-C和T-D标志牌标记后，脱牌率高于45%，成活率低于5%，T-D标记组实验鱼在标记后3 d内全部死亡。

由此可见，在本实验条件下，全长5 cm以下的苗种不适宜以标志牌标记放流，对于全长8 cm以上的苗种标记应使用T-A标志牌，对于16 cm以上苗种的标志，可使用T-A和T-B标志牌。

表3 不同规格的半滑舌鳎苗种以T型牌标记后15 d的脱牌率和成活率Table 3 The tag-shedding rate and survival rate of tongue sole juveniles after tagged with T bar tags in 15 days

2.2 标志苗种的生长

挂牌标记后全长12 cm的半滑舌鳎苗种经15 d的室内暂养,放入室外池塘培育观察其标记效果。共放入标记试验苗种180尾，同等规格未标记的试验鱼180尾。经2个月池塘养殖，试验鱼出池。计数出带标记牌试验鱼178尾，不带标记牌试验鱼182尾，试验池塘养殖成活率达100%。标记试验鱼平均全长17.37±1.97 cm，平均体重达23.83±3.02 g，未标记鱼平均全长达18.07±2.02 cm，平均体重达24.59±3.64 g。结果表明挂牌标记鱼生长与未标记苗种生长无显著差异(P>0.05)(表4)，标记效果良好。

表4半滑舌鳎标志苗种在土池饲养60 d后的生长指标Table 4 The growth performance of T bar tagged tongue sole domesticated in the outdoor pond

2.3 半滑舌鳎标志放流试验

2011-11在莱州三山岛近海进行了半滑舌鳎规模化放流试验，放流半滑舌鳎苗种52万尾，其中利用T-A标志牌标记放流平均全长12 cm的半滑舌鳎苗种1万尾。

标志放流流程：根据上述实验结果，使用T-A标志牌对平均全长12 cm的半滑舌鳎苗种进行了标记，标记后利用3个室内圆形水泥池(规格为6 m×6 m×1 m)流水暂养48 h，出池打包后装船放入大海。出池时计数池中苗种死亡个体数量及脱落的标志牌数量，统计出该标志牌标记暂养成活率达99.9%，脱牌率为0.15%，表明标记效果较好。

3 讨 论

本研究首次研制并探讨了不同规格的T型标志牌对半滑舌鳎苗种的标记效果，筛选出了适宜于半滑舌鳎苗种标记的T型标志牌，提出了规范的标记方法，为半滑舌鳎增殖放流及效果评估提供了重要的手段和工具。

3.1 T型标志牌规格与脱牌率和成活率的关系

T型标志牌的锚定端、连接线和标志牌等部分的尺寸,特别是锚定端的长度和直径直接影响标记效果。半滑舌鳎苗种体细长且肌肉厚度较薄，在挂牌标记时，较大规格的T-D和T-C标志牌很容易在鱼体的锚定部位造成较大的创口而脱牌或造成死亡。本研究研制的小规格T-A标志牌，大大缩短了锚定端的长度和直径，以适合于小规格苗种的标记。对于半滑舌鳎苗种的标志实验表明，标志牌锚定部位的创口较小，且标志牌所用材料与鱼体连接处有较好的生物相容性，标志后15 d伤口已愈合，标志鱼的脱牌率和死亡率低。在对条纹鲈(Moronesaxatilis)的标志放流研究中，研究者认为T型标志牌锚定端长度应尽量等于或者小于被标志鱼的脊椎骨间距[13]。在本研究中，对于小规格的苗种，利用T-A标志牌取得了较好的标记效果，但使用锚定端长度和直径都较大的T-C和T-D类型的标志牌则造成了较高的脱牌率。因此，对于鲆鲽鱼类小规格苗种的标志研究，首先应考虑标志牌锚定端直径的大小，同时应考虑标志牌重量和操作方法等因素。

已有研究表明，T型标志牌的连接线长度可能影响标记成功率，连接线过短可能导致较高的脱牌率[14]。但另一方面，较长的连接线会增加标志牌的整体重量，在水里产生较大的阻力，进而对鱼体的游泳行为造成影响，最为主要的是标志鱼被捕食者发现的几率增加。因此，在制作T型标志牌时应通过实验而确定适宜的连接线长度。Jolivet等[7]在研究欧洲无须鳕(Merlucciusmerluccius)标志放流时提出，标志牌重量与鱼体重的比值(R)>2时被标志鱼死亡快且死亡率高，脱牌率升高。在本研究中，对于平均全长8 cm的苗种，T-A标志牌较为适宜，结合表2中的R值，认为当R<0.63时标志牌适宜于标志放流。而对于全长为12 cm以上的大规格苗种，考虑到标记后的成活率和脱牌率，以R=0.3来评价标志牌对半滑舌鳎的标志效果较为适宜，当R<0.3时标志牌较适宜于标记操作。在本研究条件下，从脱牌率、存活率和实验鱼的标志后行为以及生长等数据综合分析，T-A标志牌适宜于全长8 cm以上半滑舌鳎苗种的标志，而T-B标志牌适宜于16 cm以上大规格苗种的标志。同时，该T-A型标志牌也可用于其它鲆鲽类苗种挂牌标志。

3.2 其它因素对挂牌标记效果的影响

T型标志牌的挂牌标志多采用标志枪操作，Davis等[15]发现标志枪的枪头过短也可引起较高的脱牌率。本研究中，根据4种不同的T型标志牌锚定端的直径制作了不同的标志枪，要求枪尖和撞针的直径与标志牌锚定端吻合，枪尖入鱼体后不会产生倒挂而造成额外损伤或者将标志牌拖出。另外，在标记操作时，要求枪尖斜向入肌肉深度控制在5 mm左右，以不穿透鱼体为好，避免对鱼体造成过大损伤。

在利用T型标志牌标记放流鱼时，由于锚定端需镇入鱼体内，因此会在鱼体标志部位造成创伤。对鲑鱼(Salmosalar)的标志技术研究表明，如若标记操作或操作后处理不当，或者标记后不经暂养直接放入野生环境中，标志鱼的标志部位容易恶化，形成坏死，直接导致实验鱼的死亡或生长抑制[14，16]。因此，在标志放流过程中，应对标记后的鱼体进行创口的消毒处理并对标记后的实验鱼进行暂养驯化，以提高标志鱼的成活率。本研究的标记操作中，标记前对标志枪头进行了消毒处理并在标记后对放流鱼进行消毒处理，标志鱼体上的标记创口可在较短时间内愈合，对实验鱼的生长和存活影响较小；另外，标记操作时，T型标志牌标记部位选在试验鱼头部后方侧线上方肌肉最厚处，此处远离中枢神经系统和血液循环系统，不会对标志鱼产生过多的生理和代谢胁迫；同时，标记操作时标志枪倾斜并与鱼体呈45°～60°角，可使标记后标志牌向鱼体侧后方倾斜并与鱼体游泳方向保持一致，减少游泳阻力的影响。

目前，开展的不同类型的标志牌的标记效果试验多是在实验室条件下进行，在标记后暂养周期的长短可能对评价一种标志牌的效果产生影响。前人研究表明，短期内(2～5 d)的暂养观察可能无法精确评估一种标志牌对实验鱼的效果，因此一般标志后的暂养实验时间需5 d以上，暂养时间越长，对于标志牌的标志效果就越容易评价和确定[17]。本研究中，半滑舌鳎标记鱼的暂养时间为15 d，同时在池塘中进行暂养时生长无差异，同时在后续大批量标志放流时中发现较高的成活率和较低的脱牌率，表明本研究使用的暂养和标志效果评价方法是适宜的。

3.3 适宜标志苗种的规格

Nielson等[1]提出挂牌标记一般用于个体较大的鱼，如体长在15 cm以上的鱼[13-14]。本研究使用的标志用苗种都在16 cm以下，全长5 cm的苗种由于体型过于单薄和弱小，不适用于挂牌标记操作，其可能原因是小规格苗种难以忍受固着时的操作压力所造成的创伤，从而造成死亡。对于全长8 cm以上苗种，虽然其全长达到一定规格，但苗种体重较小，在进行苗种标志时，需特别注意标志牌的重量不可过大，重量过大的标志牌可对苗种游泳和摄食行为造成障碍，且很容易在自然水体被其天敌生物捕食。因此，开发适宜半滑舌鳎苗种标记的标志牌时，应尽量制作小规格标志牌。从本研究结果看，全长8 cm的苗种在以T-A标志牌标记后虽成活率达90%以上，但仍有少量死亡和脱牌，本研究虽未选择10 cm左右的苗种进行标记试验，考虑到苗种的规格、身体厚度以及标记操作技术，建议今后标志放流时，使用T-A标志牌，选择全长10 cm以上的半滑舌鳎苗种进行标记放流为宜。

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