响应面法优化南极菌Psychrobacter sp.B-3的发酵产糖条件

张 曲，宋益民，李 江

(1.青岛科技大学 化工学院，青岛 山东 266042；2.国家海洋局 第一海洋研究所，青岛 山东 266061)

微生物在当今被普遍认为是一些生物活性物质和新化合物的高效生产者[1]。而生存于极地的微生物由于气候极其苛刻、恶劣，这也意味着来自于极地微生物的生物活性物质对于人类可能具有特殊的意义[2]。极地微生物(海冰微藻和细菌)分泌产生大量的胞外多糖(EPSs)，这些物质聚集在冰藻和细菌生存的海冰通道中，提供了海冰和冰水界面的有机碳，是能源传输的主要物质[3]。除了其生态学上的作用，国内外学者开始关注胞外多糖的生物学活性，在前期的研究工作中，从南极嗜冷杆菌Psychrobactersp. B-3的发酵液中分离获得的胞外糖能够显著地诱导植物体内多种抗氧化酶的活性，以清除植物在受到伤病侵害时大量积累的活性氧，从而有效地防治设施蔬菜的病害。单独施用EPS-B3对黄瓜白粉病和枯萎病的防治率分别达到42.99%和83.09%，因而具有广阔的开发潜力[4]。但微生物EPSs产量低而不稳定限制了其开发应用，因此如何提高EPSs的产量显得尤为重要。

响应面法是先利用合理的试验设计并通过实验得到的一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法[5]。本研究以南极菌Psychrobactersp.B-3菌株为研究对象，通过单因子实验，Plackett-Burman设计，Box-Behnken实验设计及响应面分析法等统计学方法，高效地实现了南极菌Psychrobactersp.B-3产胞外多糖的优化，为该胞外多糖以后的应用研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

南极菌B-3源自中国第24次南极科学考察乌拉圭站(62°11′50.52″S，58°55′50.4″W)采集的海冰样品，采用佐贝尔2216培养基筛选、分离获得，经16S rDNA鉴定为Psychrobacter属。

1.1.2 培养基

液体种子培养基：蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L，陈海水：自来水为2:1，即2216E培养基。

初始液体发酵培养基：蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L，陈海水：自来水为2:1，MgCl20.02 g/L。

发酵培养的初始温度为10 ℃, pH为7，摇床转速为150 r/min，发酵时间为72 h。

1.2 方 法

1.2.1 苯酚-硫酸法总糖标准曲线的制备

葡萄糖标准溶液的制备：准确称取无水葡萄糖10 mg，加入100 mL容量瓶中，定容至刻度，浓度为100 μg/mL。利用苯酚-硫酸法测出葡萄糖的标准曲线[6]。

1.2.2 单因素筛选

分别以温度、pH、碳源、氮源、金属离子及海水配比作为参数进行单因素优化实验，考察其对产糖量的影响。为确定各种环境因素对南极菌Psychrobactersp.B-3发酵产糖量的影响水平，通过选择最佳的碳源，氮源及金属离子来进行下一步的响应面优化实验。

1.3 Plackett-Burman实验设计及分析

根据前期单因素实验及其它可能影响产糖的因素，选择了10个因素：蛋白胨(X1)，酵母粉(X2)，海水配比(X3)，pH(X4)，温度(X5)，摇床转速(X6)，接种量(X7)，装液量(X8)，培养时间(X9)，BaCl2(X10)，来进行12次实验(N=12)，用Plackett-Burman软件进行实验设计，实验中每个因素分别设高(1)，低(-1)两个水平。以发酵液中的产糖量为响应值，通过SAS软件对实验结果进行回归显著性水平，选择可信度高的显著因素进一步开展响应面显著性分析，根据结果对其进行显著性分析。实验中每个因素根据单因素实验结果设定2个水平。

1.4 Box-Behnken设计及响应面分析

根据Plackett-Burman实验确定的影响产糖的显著因素，采用响应面软件对其进行Box-Behnken响应面设计，以发酵液中的产糖量为响应值，通过SAS软件对实验结果进行回归分析，从而获得南极菌B-3发酵产糖的最佳条件。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

以葡萄糖为标准品，根据标准曲线绘制方法进行标准曲线绘制，对测定数据用最小二乘法进行线性拟合，得到回归方程为y=0.002 3x-0.004 8(R2=0.991 3)。

2.2 单因子实验筛选结果

我们分别考察了温度、pH、碳源、氮源、金属离子及海水配比对产糖量的影响(图1～6)。结果表明，最佳碳源为酵母粉，最佳氮源为蛋白胨，最佳金属离子为BaCl2，陈海水与自来水配比为2:1，温度10 ℃，pH为7。

图1 不同温度对产糖的影响Fig.1 Effect of various temperatures on EPS production

图2 不同pH对产糖的影响Fig. 2 Effect of various pH on EPS production

图3 不同碳源对产糖的影响Fig.3 Effect of various carbon sources on EPS production

图4 不同氮源对产糖的影响Fig.4 Effect of various nitrogen sources on EPS production

图5 不同海水比例对产糖的影响Fig. 5 Effect of various seawater proportions on EPS production

图6 不同无机盐对产糖的影响Fig. 6 Effect of various salts on EPS production

2.3 Plackett-Burman设计筛选结果

在前期单因子实验的基础上，本实验选取可能影响产糖的10个因素：蛋白胨、酵母粉、海水配比、pH、温度、摇床转速、接种量、装液量、培养时间、BaCl2。来进行实验次数N=12的Plackett-Burman实验。10个因素分别对应于表1中的10个列，每个因素分别取低水平“-1”和高水平“1”，并另设1个虚拟列，考察实验误差，以发酵液中产糖质量浓度为响应值(Y)，实验设计及结果见表1。运用SAS软件，对实验结果进行分析，得出各因素的t值和可信度水平，各因素主效应分析见表2。

一般选择可信度大于90%以上的因素作为显著因素[7]。由表2的主效应分析结果可知，在PB设计的二水平范围内，影响南极菌B-3产糖的主要因素为酵母粉浓度、海水配比和装液量，其可信度区间均在90%以上。由于发酵培养基的碳源、氮源均已确定，而其他因素对产糖的影响不显著，故在下一步响应面分析中需要进一步考察酵母粉浓度、海水配比和装液量对产糖量的影响，其余不显著因素按照正负效应确定，正效应取高值，负效应取低值，即蛋白胨6 g/L，接种量1.5 %，培养时间64 h，BaCl20.03 g/L，并且根据实验操作的实际情况将温度定为10 ℃，转速150 r/min，pH为7。

表1N=12的Plackett-Burman的实验设计及响应值Table 1 Experimental design of Plackett-Burman and corresponding results(N=12)

表2Plackett-Burman实验设计的因素水平及效应分析Table 2 Factors, levels and effect estimates of Plackett-Burman design

2.4 响应面分析

2.4.1 响应面实验设计方案与结果

根据Plackett-Burman实验结果，选择酵母粉浓度、海水配比和装液量为优化对象，以发酵液中产生的总糖含量为响应值来设计中心组合实验，所设计的重要因素水平及编码见表3，Box-Behnken实验设计方案及结果见表4。

表3响应面因素水平编码表Table 3 Factors and levels of response surface design

表4Box-Behnken实验设计与结果Table 4 Experimental design and results of Box-Behnken

2.4.2 二次回归方程拟合及方差分析

回归方程的方差分析和可信度分析结果分别见表5和表6。

表5回归方程的方差分析Table 5 ANOVA for the RSM experiment

表6模型可信度分析Table 6Reliability analysis for the modle

通过回归方程的方差分析(表5)可知，回归模型F值检验显著(P=0.000 1<0.01)，失拟项不显著(P=0.090 8>0.05)，即该模型在被研究的整个回归区域拟合较好。从模型可信度分析(表6)可知，其决定系数(R2)=99.40%，这表明由这3个因素及其二次项能解释响应值(Y)变化的99.40%，说明模型的相关度较高；校正决定系数(Adj.R2)=98.64%，表明98.64%的实验数据的变异性能用此回归模型解释；预测决定系数(Pred.R2)=0.924 5,预测决定系数较高，说明模型对实验预测的可靠性达92.45%,说明模型可靠性较好；Y的变异系数(C.V.)=1.48%，较低，说明实验操作性较高。由此可见，该回归模型具有较好的拟合度，可用该回归方程对南极菌B-3产糖量进行分析和预测。

在α=0.05的显著水平上，3个关键因素在所确定的浓度范围内对产糖的影响都是显著的，在所选的各因素水平范围内，按照其对结果的影响排序为:酵母粉浓度>海水配比>装液量。

2.4.3 响应面分析显著因子水平的优化

利用SAS软件对二次回归模型进行规范分析，通过回归方程来绘制分析图，考察所拟合的相应曲面形状，酵母粉浓度、海水浓度、装液量之间的立体分析图和等高图见图7～9。

结合图7～9，运用响应面软件进行分析，在回归方程中存在稳定点为极大值，得到极大值所对应的各主要因素(C1，C2，C3)的编码值分别为(0.331,0.204,0.084),其对应的实际值为(1.07,65.05,50.84)，即酵母粉浓度、海水浓度、装液量的最佳值分别为1.07 g/L，65.05%，50.84%，而此时模型发酵液中的产糖量最高，其预测值为613 μg/mL。

图7 酵母粉浓度和海水浓度对产糖的交互影响Fig. 7 Reciprocal effect of yeast extract concentration and seawater concentration on EPS production

图8酵母粉浓度和装液量对产糖的交互影响Fig. 8 Reciprocal effect of yeast extract concentration and liquid volume on EPS production

图9海水浓度和装液量对产糖的交互影响Fig. 9 Reciprocal effect of seawater concentration and liquid volume on EPS production

2.4.4 模型实验

为了验证响应面优化设计的准确性，以模型分析确定影响产糖主要因素的浓度来配置发酵培养基，并根据实验操作的合理性，确定酵母粉浓度为1.1 g/L，陈海水与自来水的配比为2∶1，装液量为50%，其余发酵条件按Plackett-Burman实验确定，即蛋白胨6 g/L，接种量1.5%，培养时间64 h，BaCl20.03 g/L，温度10 ℃，转速150 r/min，pH为7，共进行3组实验，每组至少3个样本进行发酵。3组的平均产糖量分别为621 μg/mL,619 μg/mL，632 μg/mL，均值为624 μg/mL。这是原始发酵培养基平均444 μg/mL产糖量的1.4倍，产量提高了40%。实验结果与预测值较接近，说明回归方程能够比较真实地反映各筛选因素对产糖量的影响，可见，用该回归模型优化南极菌B-3产糖发酵培养基和条件是可行的。

3 讨 论

糖类是自然界分布最广、含量最丰富的生物高分子聚合物，也是自然界中分子结构最复杂的一类物质[9]。它们与蛋白质、核酸、脂肪一起组成了生物体内最重要的四类高分子化合物。糖的研究在经历了1个多世纪的缓慢发展之后，从20世纪70年代开始，随着分离分析技术的进步和分子生物学的发展，逐渐又得到了复兴，并取得了巨大进展，糖生物学研究正成为生命科学研究领域又一新的前沿和热点[10]。

一些糖类物质具有抗肿瘤，抗氧化性，和增强机体免疫力等非常有益的特性[11]。有些糖类物质特别适合用于制造功能性食品，这些糖类具有巨大的工业应用价值，并在众多领域拥有着诱人的前景[12]。目前，我国虽在一些糖类的研究中取得了一定的进展，但在糖类的工业化过程中还存在着糖产量较低，产糖菌种较少等问题。因此，关于一些产糖菌的发酵培养条件优化就显得尤为重要。

传统的生物过程优化大多采用单一的单因素设计，较繁杂的正交设计或单一的响应面分析[13]。而本研究针对单一使用响应面法的不足之处，高效整合单因子实验、Plackett-Burman设计、响应面中心组合设计等统计学方法,准确快速地实现了南极菌Psychrobactersp.B-3菌株产胞外多糖条件的优化研究，获得了理想的结果。本研究从众多影响产胞外多糖的因素中筛选出了主要因素并实现了因素水平的优化，较大地提高了南极菌B-3的产糖量，为以后的扩大生产和工业化利用打下了坚实的研究基础。

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