温盐变化对北极海冰细菌质膜的影响研究

窦京娇，王 燕，孙 岳，林学政，姜 伟*

(1.山东轻工业学院 食品与生物工程学院，山东 济南 250353；2. 国家海洋局 第一海洋研究所，山东 青岛 266061；3. 国家海洋局 海洋生物活性物质重点实验室，山东 青岛 266061；4. 国家海洋局 海洋咨询中心，北京 100860)

北极地区具有独特的地理及气候特征，除部分地区在短暂的夏季有冰雪融化外，其余均常年被冰雪覆盖，且环境温度在0～-50 ℃[1]。海冰是个半固体矩阵，冰晶间弥漫着大小不等、充满卤水的孔、道网络，在海冰内部形成了一个温度、盐度以及营养盐浓度急剧变化地封闭或半封闭的微生境[2]。在海冰融化过程中，局部盐度急剧降低(<10)，相反在海水结冰的过程中，由于盐分被排斥在冰晶之外，形成盐囊和盐通道，造成其中的盐度急剧上升(>150)。因此，海冰微生物不仅要经受温度的季节性变化，还要经受盐度的季节性变化[3-4]。尽管海冰环境特征具有强烈的负效应，但生存于海冰中的微生物在长期的进化过程中形成了一系列适应该生境所需的复杂的生理和新陈代谢特征，形成了独特的适应机制。

对细胞的生存和生长来说，有功能的细胞膜是必不可少的。温度降低对膜产生的影响首先表现为膜流动性的降低，并最终丧失功能，因此，保持低温下膜的流动性是微生物耐冷机理中的重要方面，而脂肪酸的种类和组成是细胞维持膜流动性的决定性因素[5]。嗜冷菌可能具有在非常低的温度下就可以发生相变的膜脂。许多微生物通过改变细胞膜的脂肪酸组成来保持其在低温时的流动性。最常见的反应是通过增加去饱和酶的活力提高脂双层中不饱和脂肪酸的质量分数；另一反应是缩短脂肪酸酰基链的长度、增加支链脂肪酸的比例或降低环状脂肪酸的比例[6]。盐度升高细菌受高渗透压的影响，将破坏细菌的细胞膜，从而影响细菌的生理活动。在高盐环境条件下，细胞为了维持正常的细胞形态和正常的生理功能必然会调动机体的生理生化反应，以便加强细胞膜的完整性和流动性。程书梅等[7]研究发现在高盐冲击条件下，耐盐突变株细胞膜的稳定性明显高于亲株，由此推断维持细胞膜的稳定性也是菌株抵御高盐冲击的一个重要原因。

我们通过分析温、盐变化对北极海冰细菌脂肪酸组成及质膜流动性的影响，将有助于人们对其低温和高盐适应方式有进一步的认识，以期为北极海冰细菌的环境适应机制提供科学依据，同时也为开发利用北极海冰细菌中的不饱和脂肪酸提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 菌株

菌株a24-4,R03-1和R03-8取自中国第4次北极科学考察所采集的海冰样品，采用Zobell 2216E培养基筛选分离获得，16S rDNA鉴定结果表明3株菌均属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonassp.)，为革兰氏阴性菌。

1.2 主要仪器、试剂和培养基

气相色谱-质谱联用仪(7890A GC; 5975C MSD)、F-4500荧光分光光度计(日本岛津)、低温振荡培养箱(HZQ-F100)、脂肪酸甲酯混合标准品(Sigma公司)、1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)(Sigma公司)；甲醇、正己烷为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

所使用培养基于1×105Pa下湿热灭菌20 min，不同盐度培养基的成分见表1。海水取自山东青岛海域，盐度约为30。

表1 培养基成分Table 1 Components of culture media

1.3 不同培养条件下菌株的培养

1)对照组：按2%接种量把菌株接种于盐度为30培养基中，10 ℃， 150 r/min振荡培养72 h；

2)低温培养：按2%接种量将菌株接种于盐度为30的培养基中，0 ℃, 150 r/min低温培养箱振荡培养144 h；

3)低温胁迫：按对照组方法培养菌株24 h后移至0 ℃,150 r/min低温振荡培养48 h；

4)高盐培养：按2%接种量将菌株接种于盐度为90的培养基中，10 ℃,150 r/min振荡培养72 h；

5)高盐胁迫：按对照组方法培养菌株24 h，菌体离心浓缩加入盐度为90的培养基中继续培养48 h。

1.4 细胞膜流动性测定

1)取一定量的菌悬液，4 000 r/min离心5 min；2)收集菌体，用PBS洗涤2次，并重悬于PBS缓冲液中，调整其数量约为108个/ mL；3)取2 mL菌液，加入4 mL浓度为2×10-6mol/ L的DPH，30 ℃温育30 min，即得到DPH标记的细胞膜。用带有偏振装置的荧光分光光度计测定并计算荧光偏振度[8]。检测条件：温度25 ℃，激发波长Ex=362 nm， 发射波长Em=432 nm,激发狭缝10 nm，发射狭缝10 nm。

荧光偏振度

(1)

(2)

式中IVV为起偏器和检偏器光轴同为垂直方向时测得的荧光强度；IVH为起偏器和检偏器光轴分别为垂直和水平方向时测得的荧光强度；G为光栅校正因子；IHV为起偏器和检偏器光轴分别为水平和垂直方向时测得的荧光强度；IHH为起偏器和检偏器光轴同为水平方向时测得的荧光强度。

1.5 细菌细胞膜脂肪酸组成的分析

细胞膜脂肪酸样品处理：1)将培养好菌体置于-80 ℃冷冻干燥，然后置于10 mL螺口试管中，加入5 mL 0.4 mol / L 的KOH-CH3OH溶液，60 ℃下皂化1 h。2)冷却后加入4 mL体积比为1∶9的HCl-CH3OH，60 ℃水浴20 min，冷却。3)加入2 mL 3%NaCl溶液，用1 mL色谱纯正己烷萃取甲酯化的脂肪酸[9]，萃取样品利用GC-MS联用仪进行检测。

色谱条件：DB-5MS毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm膜厚，Agilent)，载气为高纯氦气(99.999%)，流速1.0 mL / min，进样器温度280 ℃，柱温280 ℃，检测温度260 ℃，进样量1.0 μL。

质谱条件：电离方式EI，电子能量 70 eV, 离子源温度 230 ℃, 四极杆温度150 ℃。

定量分析：采取面积归一化法分析各脂肪酸组分的质量分数。

1.6 数据处理与统计分析

通过SPSS(Version 19.0，SPSS Inc.)软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 温度和盐度对菌株生长的影响

将分离自海冰样品的3株菌a24-4，R03-1和R03-8分别于不同温度(0，5，10，15，20和25 ℃)和不同盐度(0，30，60和90)条件下培养，观察温度和盐度对菌株生长的影响，结果如图1(图中OD值为实测值×稀释倍数)。由图1可知，当培养基盐度为0，温度为0～20 ℃时菌体均不生长。而当培养温度为25 ℃时，菌株有生长现象，OD值约1.0，在盐度为0时3株菌出现了不同的生长情况，推测可能由于菌株a24-4与R03-1、R03-8对盐度的需求不尽相同造成的。培养基盐度为30，60和90时，菌体均在培养温度为10 ℃达到最大生长量；在培养温度为0，5和10 ℃时，培养基盐度为30时，菌体OD值最大，而温度为15，20和25 ℃时，菌株在盐度为60时OD值最大。与a24-4生长情况不同，R03-1和R03-8在盐度为0时各个培养温度下均不生长，但均在培养温度为10 ℃，培养基盐度为30时达到最大量。因此3株菌均为嗜冷耐盐菌，最适生长温度和盐度分别为10 ℃和30。

2.2 温度对细胞膜流动性和脂肪酸组成的影响

2.2.1 温度对细胞膜流动性的影响

温度对细胞膜流动性的影响结果如表2所示。温度影响细胞膜的流动性，温度越高，分子的能量越大，分子运动速度加快，膜脂的活动性就越大，荧光探针易于进入类脂双层而标记上。如果膜脂质烃链活动性很大，则DPH分子从吸收到发射随磷脂分子的活动而有不同程度的倾斜或转动，以致发射的荧光偏振度减少，即膜脂流动性增大；反之，如果脂质烃链活动性小，则DPH分子从吸收到发射在磷脂分子中排列整齐，发射的荧光偏振度值大，则膜脂的流动性小，荧光偏振度与膜流动性成反比。由表2知，菌株a24-4在低温胁迫和低温培养时细胞膜的荧光偏振度分别从0.253升高到0.258和0.265，与对照组相比差异不显著(P>0.05)；与此相同，菌株R03-8和R03-1在低温下和低温胁迫时荧光偏振度与对照组相比变化也不大(P>0.05)，表明低温下细胞质膜维持着正常的流动性。这与JAGANNADHAM等研究发现南极细菌Sphingobacteriumantarcticus生长在5 ℃环境下与生长在25 ℃环境下的膜流动性基本相同[10]的结果一致。

图1 不同温度和盐度对菌株生长的影响Fig.1 Effect of different temperature and salinity on the growth of strains

表2 温度对细菌细胞膜荧光偏振度(P)的影响Table 2 Effect of temperature on the fluorescence polarization(P) of bacteria cell memrane

2.2.2 温度对脂肪酸组成的影响

由表3可知，3株菌均能够合成多种脂肪酸，包括直链饱和脂肪酸(C16∶0,C18∶0)和其他一些低熔点脂肪酸，如单不饱和脂肪酸(C16∶1,C18∶1)、支链脂肪酸(14-Me, C15∶0；15-Me, C16∶0)和环甲基脂肪酸(顺-9,10环甲基十七烷酸、顺-9,10-甲基十九烷酸)。与对照组相比，低温胁迫和低温培养时3株菌质膜脂肪酸组成和质量分数均发生了变化：1)3株菌质膜总单不饱和脂肪酸(UFAs)质量分数均明显升高，在单不饱和脂肪酸中，C15∶1和C17∶1质量分数表现为降低，C16∶1和C18∶1质量分数升高，以C16∶1质量分数的变化最为显著，对照组膜脂肪酸组成中C16∶1质量分数达到40%左右，而低温培养时其质量分数可达60%以上；2)3株菌株在低温胁迫和低温培养时支链脂肪酸(BCFAs)质量分数均明显升高，会出现甲基分支和甲基异构分支现象，如15-Me, C16∶1、14-Me, C16∶0，同时还会产生环甲基分支结构，如Cis-9,10-Me, C16∶0和Cis-9,10-Me, C18∶0。由此可见，3株菌通过调节细胞膜脂肪酸不饱和度和支链化程度来适应低温环境；由各单不饱和脂肪酸的变化趋势可知C16∶1可能对维持细胞膜流动性起着关键作用，而C15∶1和C17∶1两种脂肪酸对菌株的低温生长是非必需的。综上所述，在冷适应条件下，3株菌均通过调节细胞膜脂肪酸不饱和度和支链化程度来降低熔点，进而增强菌株对冷的耐受力。

表3 温度对脂肪酸组成影响(质量分数/%)Table 3 Effect of temperature on the fatty acid composition(mass fraction/%)

注：“-”代表未发现

2.3 盐度对细胞膜流动性和脂肪酸组成的影响

2.3.1 盐度对细胞膜流动性的影响

由表4知，3株菌在高盐胁迫和高盐环境下生长时，荧光偏振度增大，细胞膜流动性均有所降低，但无显著性变化(P>0.05)。可能由于菌株本身为耐盐菌，在高盐条件下为适应环境，其可通过调节细胞膜组分维持一定的细胞膜流动性，来抵御高盐冲击。

表4盐度对细菌细胞膜荧光偏振度(P)的影响

Table 4 Effect of salinity on the fluorescence polarization(P) of bacteria cell membrane

项 目菌 株a24-4R03-1R03-8对照组0.253±0.0040.272±0.0030.191±0.007高温胁迫0.268±0.0050.279±0.0050.216±0.009高盐培养0.263±0.0090.277±0.0050.212±0.004

2.3.2 盐度对脂肪酸组成的影响

由表5知，高盐培养时3株菌支链脂肪酸比例均显著升高。因此，在对高盐的适应过程中，支链脂肪酸的增加起重要作用：高盐条件下，此3株菌通过调节细胞膜中支链脂肪酸的组成来维持细胞膜流动性，进而抵御高盐冲击，减少高盐对质膜的损伤。从不饱和脂肪酸组成来看，3株菌的变化趋势不尽相同，而 C16∶1在3株菌中质量分数均显著升高，由此推测，C16∶1可能在高盐环境下也是维持细胞正常生长的一个关键因素。

表5 盐度对脂肪酸组成影响(质量分数/%)Table 5 Effect of salinity on fatty acid composition(mass fraction/%)

注：“-”代表未发现

3 讨 论

极地生态系统的独特性为研究恶劣条件下微生物的适应机制提供了极好的资源。细菌Pseudoalteromonassp.a24-4,Pseudoalteromonassp.R03-1和Pseudoalteromonassp.R03-8分离自北极海冰样品。低温下3株菌质膜均能维持正常流动性，膜不饱和脂肪酸和支链脂肪酸质量分数增加，说明菌株在低温环境下通过调整质膜脂肪酸不饱和度和支链化程度来增加膜的流动性，增强菌株对冷的耐受力。这与Sofia等[11]，Fernandez等[12]，Wang等[13]和Chiar等[14]的研究结果一致。

低温可以减慢大多数的生理进程，降低膜的流动性，会导致细菌细胞质膜上脂肪酸链更紧密的排列，使脂双层凝胶化，从而限制了分子的运动，影响膜的功能。因此，维持最佳的膜流动性就成为微生物在低温下生存的关键，而脂肪酸的种类和组成是细胞维持膜流动性的决定性因素。

对南极细菌外的其它冷适应性细菌的研究初步揭示了这些微生物为维持细胞质膜正常的流动性而采取的几种策略。首先，通过冷诱导去饱和，使饱和脂肪酸转变成不饱和脂肪酸的策略是非常普遍的，并且不饱和脂肪酸对膜的流动性影响显著；其次，通过降低脂肪酸链的长度和合成支链脂肪酸来保持膜最佳流动性[15]。低温下，质膜中脂肪酸的代谢发生了显著变化，包括双键的引入、脂肪酸链长度的降低和改变组成成分等，从而降低了膜的相变温度，保持在低温条件下的生物学功能[16]。李博等[17]研究发现，低温下革兰氏阳性菌主要利用分支脂肪酸来调整膜的流动性；而革兰氏阴性菌则呈现较为多样的适冷机制，10%以下革兰氏阴性细菌以支链饱和脂肪酸为主要膜脂调整方式，绝大多数阴性菌以不饱和直链或不饱和支链脂肪酸为主要形式存在，即主要以不饱和键的形式来调整膜脂在低温环境下的流动性。

在高盐环境下，细胞通过细胞膜的被动应答和细胞内的主动调控，相应调整细胞膜的物理特性，进而抵御其对细胞造成的伤害。本研究表明：菌体通过调节质膜中支链脂肪酸的组成来增加对高盐的抗性，显示菌体通过这种积极的反应保护细胞，从而维持质膜的正常流动性。

目前关于盐度对脂肪酸组成的研究报道很少，仅发现Xu等[18]对Dunaliellasp.高盐适应性的研究报道，文中指出总饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的质量分数随着盐度的增加而升高，多不饱和脂肪酸的质量分数随着盐度的升高而降低，本实验结果与此不太一致，仅R03-1质膜总不饱和脂肪酸质量分数随盐度升高而升高，而a24-4和R03-8质量分数却略有降低。但是C16∶1质量分数表现出明显增加的趋势，这与低温培养时，3株菌中C16∶1质量分数也明显增高结果一致。由此推测，C16∶1可能是北极海冰细菌环境适应过程中质膜脂肪酸组成中的必需脂肪酸，但有关C16∶1在适应极端环境中的地位及其作用机制还需进一步探讨。

总之，在低温和高盐环境条件下，北极海冰细菌通过脂肪酸组成的变化保护膜正常流动，从而维持细胞正常功能，这是北极海冰细菌适应极端环境的一种机制。

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