糖尿病肾损害大鼠血清抗血管紧张素II 1型受体自身抗体水平变化＊

白伟伟 赵林双 刘 晔 谭学莹

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）常见的微血管并发症之一，20%～30%的1型或2型DM患者并发DN，其中一部分进展为终末期肾病（End Stage Renal Disease，ESRD）［1］。近期研究［2］表明，早期发现和诊断DN，进而采取综合干预保护措施，可以延缓和改善肾脏病变的进展，提高DM患者的生命质量，延长寿命。目前，DN的发病原因也是DM领域研究的热点问题。G蛋白偶联受体（G protein Coupled Receptor，GPCR），尤其是抗血管紧张素II 1型受体（AT1受体）是涉及信号转导的细胞膜受体中最大的家族，它们介导的信号转导十分广泛，包括调节肾脏功能和免疫应答［3］。近年来，有临床研究发现肾损害患者血清中存在针对机体心血管调节受体的自身抗体，尤其是抗GPCR的自身抗体，且其水平变化与血肌酐（Scr）有关，故推测该抗体可能是DM合并肾损害的重要因素之一［4］。但迄今未见相关文献报道。本研究通过检测分析血清抗血管紧张素II 1型受体自身抗体（Autoantibodies Against the Angiotensin II Type 1Receptor，AT1－AA）阳性DM大鼠24h尿白蛋白排泄率（UPE）、血尿素氮（BUN）、Scr水平变化，进一步探讨 AT1－AA与肾损害的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠36只，雄性，体重160～170g，由武汉大学动物实验中心提供。

1.2 主要试剂

链脲佐菌素（Streptozotosin，STZ）为美国Sigma公司出品；血糖、BUN、Scr检测试剂盒由南京建成生物工程研究所生产；尿白蛋白检测试剂盒购自北京市福瑞生物工程公司。

1.3 DM模型的建立

36只Wistar大鼠购入并适应性喂养1周后，随机选取29只用于复制DM模型组（DM组），余7只作为对照组（N组）。DM组大鼠以高糖高脂饲料（常规饲料加10%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇）喂养，N组按常规饲料（蛋白质31.1%、脂肪7.79%，其它61.11%）喂养，饲料均由广州军区武汉总医院实验动物中心提供。高糖高脂饲料喂养4周，禁食12h后，DM组大鼠腹腔注射STZ 30mg／Kg（临用前以0.1mmol／L、pH4.3的枸橼酸缓冲液配制成20g／L溶液）。N组平行注射等量枸橼酸缓冲液。72h后取尾静脉血测定空腹血糖，以血糖≥16.7mmol／L为造模成功［5］。DM 组大鼠全部造模成功。DM组造模成功后改为普食喂养，并检测以下指标。

1.4 指标测定

1.4.1 标本采集：每2周从大鼠尾尖采血测血糖（氧化酶法）。实验结束前一日清晨7∶00，将大鼠转入代谢笼内，收集24h尿液用于测定UPE（加甲苯酸防腐，混匀后记录尿量）。于实验第20周末水合氯醛麻醉下处死动物，断头取血3ml，离心后取血清测定AT1－AA和其它肾功能指标。

1.4.2 AT1－AA 检测：（1）自备 AT1：采用多肽自动合成仪（SHIMADZU PSSM－8，Shimadzu公司，日本）合成AT1受体，选择具有抗原决定簇的细胞外第二环多肽作为抗原，即AT1受体第165～191位氨基酸残基片段（序列：I－H－R－N－V－Y－F－I－E－N－TN－I－T－V－C－A－F－Y－E－S－R－N－S－T－L）。（2）ELISA 检测 AT1－AA：按照本实验室建立的方法［6，7］检测AT1－AA。以蒸馏水为空白对照，供测OD值时调零。以健康鼠血清为阴性对照，以OD值超出健康鼠两倍标准差的DM鼠血清为阳性对照。待测血清与阴性对照血清的OD值之比（待测标本OD值－空白对照OD值）／（阴性对照OD值－空白对照OD值）＞2.1判为 AT1－AA阳性。

1.4.3 生化指标测定：采用放射免疫法（按照说明书）检测24hUPE。BUN、Scr水平使用美国BECKMAN SYN CHRON－LX20全自动生化分析仪和配套试剂（苦味酸法）检测。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行统计处理。计量资料以均数±标准差（s）表示，两组均数比较用t检验，计数资料用百分数表示，两组间比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DM大鼠血糖变化

注射STZ后，DM组大鼠血糖水平（20.36±2.13mmol／L）较 N 组（5.64±0.86mmol／L）明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），并且一直维持在较高水平，直至实验结束。

2.2 DM组和N组大鼠AT1－AA阳性率比较

DM 组 大 鼠 AT1－AA 阳 性 率 为 37.93%（11／29），高于 N 组28.57%（2／7），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 A组和B组大鼠肾功能指标变化

DM组大鼠分布于A组11只，分布于B组18只。A组大鼠BUN、Scr、UPE显著高于B组（P＜0.01），提示AT1－AA与肾损害有关。见表1。

表1 A组和B组大鼠肾功能指标检测结果（s）

表1 A组和B组大鼠肾功能指标检测结果（s）

注：与B组比较，1）P＜0.01

组 别 n BUN（mmol／L）Scr（mmol／L）UPE（mg／24h）A组 11 26.35±5.871） 196.24±23.621） 168.93±10.221）B组18 19.57±3.41 124.26±9.93 131.16±11.38

3 讨 论

AT1－AA在多种疾病的发生、发展中都起着重要的作用，国内外的临床研究先后在恶性高血压、先兆子痫等患者血清中检测到 AT1－AA［8］。Dragun等［9］报道在33例难治性血管性排斥反应的肾移植患者中，16例存在恶性高血压，在这16例患者中检测到了针对AT1受体的IgG抗体。本课题组前期研究［4］已发现，DN 与 AT1－AA 有关，且针对 AT1－AA的靶向治疗能够提高降压和减少蛋白尿的临床疗效，可延缓肾功能恶化进展。

本文结果显示，在29只DM大鼠中，AT1－AA阳性率达37.93%，N组的阳性率为28.57%，DM组高于N组，提示DM肾损害的发生可能与AT1－AA有关，进一步对比分析AT1－AA阳性和阴性DM 大鼠24hUPE、BUN、Scr水平发现，AT1－AA阳性大鼠肾功能较AT1－AA阴性大鼠更差，表明DM肾损害与AT1－AA有关。这一结果支持了AT1－AA参与DN的发病机制的推测。

AT1－AA参与DM肾损害的可能机制：GPCR在受到刺激后进入胞浆，发生内化、降解、融合、转移及呈递给相应的免疫细胞，AT1受体属于GPCR结构抗体，具有激动剂样活性，可反复刺激诱导自身免疫反应，导致机体组织损伤。DN的肾小球硬化，内皮细胞损害，导致隐蔽抗原暴露，在部分易感人群诱导机体自身免疫应答，可能是GPCR自身抗体产生的途径［10］。有研究［11］表明，同样给予高糖喂养8周，AT1－AA阳性孕鼠的后代出现一系列糖脂代谢异常，并符合代谢综合征的诊断标准，与同期对照组相比，其对代谢性疾病的易感性明显增加。α1与AT1等同属于GPCR超家族，本研究组前期研究［12］已经证实，DN的发病与α1受体抗体介导的自身免疫有关，因而推测AT1－AA在DM肾损害过程中发挥与其相似的生理作用。

综上所述，AT1－AA与DM 肾损害的发生有关，但是AT1－AA是否为DN发生的关键因子，或仅是DN严重程度的一个指标，还需要更多临床实验的验证。进一步研究AT1－AA与DN的密切关系，有助于探讨DN发病机制及其与免疫学的关系，可为DN的临床治疗提供依据。

1 叶任高.内科学［M］.第5版.北京：人民卫生出版社，2001：798.

2 刘 雯，刘会贞，陈全振，等.糖尿病肾病相关因素分析［J］.中国糖尿病杂志，2011，19（suppl 6）：428～429.

3 Bansal G，Divietro JA，Kuehn HS，et al.RGS13controls GPCR－evoked responses of human mast cell［J］.Immunol，2008，181（11）：7 882～7 890.

4 赵林双，向光大，廖玉华，等.慢性肾小球肾炎患者血清抗α1受体和血管紧张素II 1型受体自身抗体与肾损害程度的分析［J］.华南国防医学杂志，2009，23（1）：43～49.

5 Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications［J］.Nature，2001，414（13）：813～820.

6 苑海涛，廖玉华，王 敏，等.系列抗心肌多肽自身抗体对扩张型心肌病的诊断价值［J］.临床心血管病杂志，2000，16（7）：313～315.

7 Liao YH，Wei YM，Wang M，et al.Autoantibodies against AT1－receptorand a1－adren ergicreceptor in patients with hyper－tension［J］.Hypertens Res，2002，25（4）：641～644.

8 Fu ML，Herlitz H，Schulze W，et al.Autoantibodies against the angiotensin receptor（AT1）in patients with hypertension.J Hypertens［J］.2000，18（7）：945～953.

9 Draun D，Muller DN，Brasen JH，et al.Angiotensin II type 1－receptor activating antibodies in renal－allograft rejection［J］.N Eng J Med，2005，352（6）：558～569.

10 Ralf Dechend，Volker Homuth，Gerd Wallukat，et al.Agonistic directed at the angiotensin II AT1recrptor in preeclampsia［J］.J Soc Gyencol Investig，2006，13（2）：79～86.

11 张 熙，张苏丽，杨光照，等.AT1抗体阳性孕鼠后代对代谢性疾病的易感性增加［J］.中国病理生理杂志，2010，26（10）：2 056～2 057.

12 刘 晔，赵林双，李德忠.α1－肾上腺素受体抗体介导对糖尿病大鼠肾小管TGF－β1表达的影响［J］.微循环学杂志，2012，22（1）：10～12.