中国广西地区健康人群E-选择素基因rs5359A／G、rs4786G／A 多态性分析＊

王春芳 韦叶生 王俊利 潘国刚 韦贵将 罗春英 黄照权，＃

人类白细胞分化抗原CD62E 即E-选择素（E-selectin），为细胞表面跨膜糖蛋白，属于细胞黏附分子（Ams）家族中选择素家族（SF）主要成员之一。它是机体内的一种促炎细胞因子，能介导白细胞与内皮细胞的起始黏附聚集，并刺激白细胞与内皮细胞的相互作用［1，2］。人类E-选择素基因全长约13kb，位于第1号染色体长臂，含14个外显子和13个内含子。国外研究［3～6］证实，E-选择素基因第2、4、11外显子分别存在G98T、A561C（5128R）、A1856G 多态性，这种多态性可能影响E-选择素基因的表达和功能，进而影响到其生物学活性。但目前有关E-选择素基因rs5359A／G、rs4786G／A 多态性的研究少见报道。本文采用单碱基延伸PCR 技术及基因测序技术对广西地区199例健康人rs5359A／G、rs4786G／A 基因的多态性进行检测，并将检测结果与人类基因组计划（Hapmap）公布的欧洲人、非洲人、日本人和中国北京人的单核苷酸多态性（SNP）分型数据比较，以探讨E-选择素rs5359A／G、rs4786G／A 多态性在不同种族和地区健康人群中的分布特点。

1 资料与方法

1.1 实验对象

中国广西地区无血缘关系的健康人199例，其中男118例，女81例，年龄25～86岁，均为我院体检中心体检健康者，各项临床及实验室指标正常，排除感染、心脑血管疾病及肿瘤等。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA 提取：EDTA-K2抗凝管采集体检者静脉血2ml；全血基因组DNA 采用碘化钠法［7］提取，-70℃保存备用。

1.2.2 引物设计与合成：根据基因库（GenBank）中人E-选择素基因rs5359、rs4786的全长序列，用计算机软件primer5.0设计引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。rs5359A／G 、rs4786G／A 引物序列均为：上游5’-TGC CCC TTT AAA AGA ASC TCT GC-3’，下游5’-TGG ATG TGC TTT GCA TTC CTA CA-3’。rs5359A／G 延伸引物为：5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TGC ATT CCT ACA AAG ATG TTT GTC AGA T-3’；rs4786G／A 延伸引物为：5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TGC ATT CCT ACA AAC TGG CTG AAC ACT GGC AAC-3’。

1.2.3 单碱基延伸PCR 及基因测序：E-选择素基因rs5359、rs4786的PCR 扩增体系均为25μl，其中10×PCR 缓冲液（Takara公司）2.0μl，上、下游引物（10pmol／μl）各1.0μl，0.3mmol／L dNTPs（GENERAY BIOTECH 公司）2.0μl，模板DNA 1.0μl，TaqDNA 聚合酶（Promega公司）1.0U，余纯水补足；混匀后用HotStarTaq（Qiagen 公司）进行多重PCR。PCR 扩增的条件与参数：95℃2min 解链；94℃20s，65℃40s共11个循环，94℃20s，59℃30s，72℃90s共24个循环；72℃2min延伸。并用外切酶I（EXO I）（Epicentre公司）与虾碱酶（SAP）（Promega公司）纯化PCR 产物，再用SNaPshot Multiplex kit（ABI公司）进行延伸反应，反应条件与参数：96℃1min解链；96℃10s，50℃5s，60℃30s共28个循环；4℃持续。SAP 再次纯化延伸产物，测序由上海天昊公司采用ABI 3130XL 测序仪完成；用GeneMapper 4.0（Appliedbiosystems）分析SNP分型结果。

1.3 统计学处理

所有资料用SPSS 13.0软件包进行分析。基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，并经Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验，以表明所选研究样本具有群体代表性。采用χ2检验比较各组间基因型及等位基因频率。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E-选择素基因型分析

E-选择素基因rs5359A／G、rs4786G／A均具有多态性，扩增产物片段大小均为497bp，ABI 3130XL基因测序SNP 分型结果显示，rs5359A／G位点存在AA、AG、GG 3种基因型，rs4786G／A 位点存在GG、GA 和AA 3种基因型，并基因测序证实。见图1、图2。

2.2 E-选择素基因多态性在广西地区健康人群中的分布

χ2检验显示，rs5359A／G 位点基因型以AA 型最常见，占56.78%，等位基因以A 型频率最高，占74.62%；rs4786G／A 位点基因型以GA 型最常见，占47.24%，等位基因以G 型频率最高，占57.79%。两者基因型频率分布在男性与女性间比较无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

2.3 不同种族人群E-选择素基因多态性比较

E-选择素基因rs5359A／G、rs4786G／A 多态性分布频率与人类基因组计划（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／projects／SNP／）公布的欧洲人、非洲人、日本人和中国北京人四个人群的SNP 分型数据的比较结果表明，rs5359A／G、rs4786G／A 多态性基因型及等位基因的分布频率与欧洲人比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而与非洲人、日本人、中国北京人比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、表3。

3 讨论

图1 E-选择素基因rs5359A／G测序图

图2 E-选择素基因rs4786G／A测序图

表1 E-选择素基因型及等位基因频率在广西地区人群中的分布（n，%）

表2 不同种族及地区人群E-选择素基因rs5359A／G多态性分布频率比较（n，%）

表3 不同种族及地区人群E-选择素基因rs4786G／A 多态性分布频率的比较（n，%）

E-选择素是黏附分子选择素家族主要成员之一，为细胞表面糖蛋白，仅表达在内皮细胞上，静息时其含量甚微，只在细胞因子激活的血管内皮细胞表达，即由白细胞介素-1（IL-1）、脂多糖（LPS）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等激活的血管内皮细胞合成并释放，参与多种细胞（包括粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等）与CD4记忆性T 淋巴细胞亚群的黏附、聚集作用和动脉粥样硬化的形成［8～10］。E-选择素是体内的促炎细胞因子之一，具有广泛生物学活性，主要介导白细胞与血管壁黏附的第一阶段，因而也是血管内皮细胞损伤的标志之一。E-选择素在与冠心病、高血压、脑卒中等发生发展密切相关的炎症反应和血栓形成中起重要作用，也与这些疾病的发生有相关性［6，11，12］。还有研究［13，14］证实，E-选择素与糖尿病、风湿性关节炎、硬皮病、脓毒症等有相关性。所以，正确了解和阐明不同地域和种族人群中E-选择素基因多态性的分布特点，可为进一步研究相关疾病的发生发展提供分子遗传学依据。

本研究结果显示，在所检测人群中，rs5359A／G位点表现出AA、AG、GG 3种基因型，以AA 型最为常见，占56.78%，等位基因以A 型频率最高，占74.62%；rs4786G／A 位点表现出GG、GA 和AA 3种基因型，以GA 型最为常见，占47.24%，等位基因以G 型频率最高，占57.79%。以上两位点基因多态性分布频率与广西人群男女组间以及与非洲、日本及中国北京人群比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；而与欧洲人群比较，中国广西健康人群E-选择素基因rs5359A／G 位点A 等位基因频率（74.62%）显著低于欧洲人（89.82%），rs4786G／A 位点G 等位基因频率（57.79%）明显高于欧洲人（23.67%），两者差异均具有统计学意义（P＜0.05）。说明E-选择素基因型分布及等位基因频率在不同种族间存在明显差异，这也符合遗传学规律。

综上所述，对中国广西人群E-选择素基因rs5359A／G、rs4786G／A 多态性的研究，为分析不同种族、不同地域与E-选择素基因相关的某些疾病临床表现的差异提供了分子生物学依据，也为这些疾病的防治奠定了基础。

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