Salusin-α转染血管平滑肌细胞对ACAT1和SA-R表达的调节作用

毛晓露 曹淑彦 廖华 王宇学＊

新发现的Salusins基因是一种心血管活性肽，包含相关肽分子Salusin-α和Salusin-β，分别由28个氨基酸和20个氨基酸组成，是编码扭转蛋白2A （Torsin Family 2，Member A，TOR2A）基因的选择性剪接产物［1］。Salusin-α和Salusin-β均具有促进血管平滑肌细胞（VSMCs）和成纤维细胞有丝分裂的作用。Salusin-α可抑制人巨噬泡沫细胞形成，Salusin-β则对其具有明显促进作用［2～4］。Iso等［5］、Watanabe等［6］报道冠状动脉狭窄患者血清Salusin-α水平显著低于轻度高血压患者和健康志愿者，且急性冠状动脉综合征（ACS）患者血清Salusin-α水平下降与动脉粥样硬化（AS）程度一致，表明Salusin-α可能具有抑制AS 的作用。为了进一步阐明Salusin-α抗AS机制，通过促进和抑制Salusin-α表达，探讨Salusin-α对乙酰辅酶A 乙酰转移酶1（ACAT1）及清道夫受体（SAR）表达的影响，为其抑制VSMCs泡沫化和AS提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

ACAT1和SA-R 抗体（Cayman 公司，美国）；Salusin-α抗体（Phoenix Pharmaceuticals公司，美国）；氧化低密度脂蛋白（oxLDL）（协生生物科技有限责任公司，中国）；pcDNA3.1-EGFP 质粒（Gene-Copoeia公司，美国）；psiHIV-U6质粒（GeneCopoeia公司，美国）；人源VSMCs细胞（Cascade biologics公司，美国）；Western Blot试剂盒（KPL公司，美国），DMEM（Gibco公司，美国）；DAB 显色试剂盒（KPL公司，美国）；Lenti-PacTM慢病毒包装试剂盒（GeneCopoeia 公司，美国）；脂质体（InvivoGen 公司，美国），其它试剂由北京中生北控生物科技股份有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 构建pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP 和psi-HIV-U6-Salusin-α质粒：按分子生物学标准操作流程［7］将Salusin-α基因克隆入含有EGFP（绿色荧光蛋白）报告基因的哺乳动物表达载体pcDNA3.1和含有U6启动子的慢病毒RNA 干扰载体psiHIVU6，构建pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP 质粒和psi-HIV-U6-Salusin-α质粒，扩增、纯化鉴定，存储备用。psiHIV-U6-Salusin-α的干扰靶序列为5’-TCC GGC ACT GCG TGC TCA A-3’。按试剂盒说明书包装psiHIV-U6-Salusin-α质粒，收集病毒颗粒备用。

1.2.2 质粒转染与分组：将VSMCs悬浮于含15%胎牛血清（FBS）的DMEM 培养液中，分装于直径为60mm 培养皿中，加入oxLDL（20ug／ml）诱导试剂，37℃，5%CO2培养。待细胞生长密度达到70%，按照细胞克隆筛选法［7］用脂质体转染两种质粒入VSMCs，继续培养48h，提取蛋白备用，蛋白提取按照Western-blotting试剂盒说明书进行。对照组分为：C0组：培养VSMCs，不作任何处理；C1组：转染pcDNA3.1-EGFP 质粒，培养VSMCs；C2组：转染psiHIV-U6质粒，培养VSMCs；C3组：同时转染pcDNA3.1-EGFP质粒和psiHIV-U6质粒（两者比例为1∶1），培养VSMCs。实验组分为：P1组：转染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP质粒，培养VSMCs；P2组：转染psiHIV-U6-Salusin-α质粒，培养VSMCs；P3组：同时转 染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP 质 粒和psiHIV-U6-Salusin-α质粒（两者比例为1∶1），培养VSMCs。

1.2.3 VSMCs的Salusin-α、ACAT1和SA-R 蛋白表达分析：将提取的各组蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）［7］，将电泳完毕后的凝胶和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜于300mA 恒电流下转移1h后。凝胶用考马斯亮兰染色，以判断转移效率，PVDF 膜于37℃封闭1h，加入一抗，室温孵育1h，洗膜，加入二抗，室温孵育1h，洗膜，加入HRPDAB底物显色。用ZF-368型全自动凝胶图像分析仪（上海金鹏分析仪器有限公司）分析各蛋白条带与β-actin的灰度比值，所有测试重复三次取均值以表示各组Salusin-α、ACAT1和SA-R 蛋白表达，并比较组间差异。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件。计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP 和psiHIV-U6-Salusin-α质粒鉴定

pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP和psiHIV-U6-Salusin-α质粒经双酶切和菌落PCR 初步鉴定正确后进行测序，测序结果与GenBank公布的序列NM＿001134430.2一致。

2.2 转染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP 和psiHIVU6-Salusin-α各组Salusin-α、ACAT1和SA-R 蛋白表达

P1组Salusin-α蛋白表达高于C0组和C1组（P均＜0.01），C0组和C1组无显著性差异（P＞0.05）。P1组ACAT1蛋白表达低于C0组和C1组（P均＜0.01），C0组和C1组无显著性差异（P＞0.05）。SA-R 蛋白表达在C0、C1、P1组中的表达均无显著性差异（P＞0.05）。P2组Salusin-α表达低于C0组和C2组（P均＜0.01），C0组和C2组无显著性差异（P＞0.05）。P2组ACAT1表达高于C0组和C2组（P均＜0.01），C0组和C2组无显著性差异（P＞0.05）。SA-R 在C0、C2、P2组中的表达均无显著性差异（P ＞0.05）。P3组Salusin-α、ACAT1和SA-R表达与C0组和C3组比较，结果均无显著性差异（P＞0.05）。各组具体结果见图1和表1。

表1 质粒转染各组Salusin-α、ACAT1和SA-R蛋白表达（灰度比值，±s，n均=3）

表1 质粒转染各组Salusin-α、ACAT1和SA-R蛋白表达（灰度比值，±s，n均=3）

注：与C0组和C1组比较，1）P＜0.01；与C0组和C2组比较，2）P＜0.01

图1 质粒转染各组Salusin-α、ACAT1和SA-R蛋白电泳结果

3 讨论

最新研究表明Salusin-α水平与AS 严重程度有关［8］。AS始发于血管内膜损伤处之巨噬细胞与平滑肌细胞的泡沫化，ACAT1和SA-R 在泡沫细胞的形成中有着重要作用［9，10］。ACAT1是AS 的正调节因子，催化游离胆固醇与长链脂肪酸合成胆固醇酯，其表达上调会导致胆固醇酯合成增加而产生泡沫细胞，加速血管壁AS斑块形成［2，3］。SA-R 作为与修饰LDL结合的一系列跨膜蛋白，可介导下内皮细胞摄入修饰LDL，最终促进动脉壁内泡沫细胞和AS斑块形成［11］。

转基因干预动脉内皮细胞泡沫化是抑制AS进程的一种理想方法。本研究发现将Salusin-α基因转染至oxLDL诱导培养的VSMCs，其Salusin-α表达增加，促脂质化因子ACAT1表达降低，提示Salusin-α可抑制ACAT1表达。而将psiHIV-U6-Salusin-α转染VSMCs，其Salusin-α表达明显降低，ACAT1表达显著增加。但同时转染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP 和psiHIV-U6-Salusin-α至VSMCs，则Salusin-α表达和SA-R 表达均无明显变化。这些结果表明转染Salusin-α RNA 干扰质粒的VSMCs，Salusin-α表达受到抑制，可导致ACAT1表达增加，而Salusin-α表达增加的 VSMCs，ACAT1表达降低。这说明Salusin-α可能通过下调ACAT1的表达，抑制泡沫细胞形成，进而抑制AS的发生，其具体机制尚待进一步研究。有学者［3，6］报道，ACS患者血清Salusin-α水平降低，AS加重，反之AS减轻，与本文结论一致。本研究结果还显示，无论Salusin-α表达增加或降低，SA-R 表达均无明显变化，说明Salusin-α对SA-R 表达没有影响。SA-R 促进VSMCs脂质化、泡沫化途径可能与Salusin-α没有直接关系。

综上所述，本实验研究初步揭示了Salusin-α可下调促脂质化因子ACAT1表达，可能具有抑制AS的作用，或成为防治AS的新靶点。

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3 Watanabe T，Nishio K，Kanome T，et al.Impact of Salusin-α and-βon human macrophage foam cell formation and coronary atherosclerosis［J］.Circulation，2008，117（5）：638～648.

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5 Iso Y，Suzuki H，Sato T，et al.The mechanism of in-stent restenosis in radius stent：an experimental porcine study［J］.Circ J，2005，69（4）：481～487.

6 Watanabe T，Suguro T，SatoK，et al.Serum Salusin-αlevels are decreased and correlated negatively with carotid atherosclerosis in essential hypertensive patients［J］.Hypertens Res，2008，31（3）：463～468.

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9 Ohshiro T，Tomoda H.Isoform-specific inhibitors of ACATs：recent advances and promising developments［J］.Future Med Chem，2011，3（16）：2039～2061.

10 Hendrickx DA，Koning N，Schuurman KG，et al.Selective upregulation of scavenger receptors in and around demyelinating areas in multiple sclerosis［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2013，72（2）：106～118.

11 Li XY，Kong LX，Li J，et al.Kaempferol suppresses lipid accumulation in macrophages through the downregulation of cluster of differentiation 36and the upregulation of scavenger receptor class B type I and ATP-binding cassette transporters A1and G1［J］.Int J Mol Med，2013，31（2）：331～338.