重复大强度运动对骨骼肌蛋白质组变异研究

葛新发，董贵俊，王玉站，李可峰，潘卫东

1.Shandong Sports University，Jinan 250102，China；2.Institute of Electrical Engineering，CAS，Beijing 100190，China.

重复大强度训练已经成为提高运动员竞技能力的一种重要手段，不同时间间隔的训练会导致运动员不同训练效果的累积，同时合理间隔时间进行类似强度运动会促进骨骼肌损伤修复［6，10］。一次大强度运动后，骨骼肌泛素蛋白酶体途径基因表达升高，骨骼肌收缩蛋白降解增加，说明骨骼肌损伤修复中蛋白质合成与降解水平也发生着显著变化［2，3］；重复大强度运动导致骨骼肌肌节重塑，导致重复运动后肌肉损伤减轻，且线粒体的恢复速度先于肌节重建［1］，提示能量代谢的恢复可能对骨骼肌损伤修复具有一定意义［14］。但是，重复运动引起骨骼肌损伤修复过程中蛋白质组变异情况尚不清楚。本研究通过对Wistar大鼠进行一次大强度离心运动及一周后重复运动训练，并在运动后即刻0h、24h、48h、72h、168h股四头肌蛋白质组进行研究，分析重复大强度运动后骨骼肌损伤修复过程中存在的与能量代谢、细胞损伤修复及细胞结构蛋白相关特异蛋白，探讨重复运动对骨骼肌损伤修复过程中可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物饲养、分组及运动方案

72只5周龄雄性Wistar大鼠，体重163±11g，购自山东大学实验动物中心（生产许可证号：SCXK（鲁）20090001）。实验前大鼠均未进行过跑台运动，大鼠饲养一周后，随机分为正常对照组（CK，6只）、一次离心运动组（A组，30只）和重复离心运动组（B组，30只）3组，剩余6只大鼠备用。一次离心运动组采取速度为18 m／min、坡度－16°的下坡跑，先运动30 min 休息5 min，再运动30 min，共运动60 min。重复离心运动组在一次运动结束1周后再次进行运动（运动2 次）。对照组不运动。动物训练在山东体育学院运动人体科学重点实验室动物实验室（济南）进行，分别于一次离心运动和重复运动后即刻、24 h、48h、72h和168h 将大鼠处死（每次处死6只），取 大鼠股四头肌备用。

1.2 双向电泳的样品制备

取肌肉200 mg，洗净煎碎后加入W1 缓冲液570μl（W1缓冲液：蔗糖8.56g，1M Tris－HCl（pH7.5）2 ml，0.1 M EGTA 10ml，0.1M PMSF 1ml，加ddH2O 定容至60 ml标记为S，60ml S ＋ddH2O 定容到100 ml），巯基乙醇60 μl，研磨成匀浆后，加入W2 缓冲液570μl（W2缓冲液：60 ml S＋40ml 10%Triton 至100ml，即为W2。），继续研磨。充分匀浆后分装入1.5ml EP 管中，10 000g 4℃离心10 min，取上清。按上清液与TCA 的比例4∶1 加入TCA 溶液，摇匀，放于冰上沉淀40 min以上。15 000g 4℃离心10min，弃上清，留沉淀，即为蛋白样品。将蛋白样品换入称好重量的EP管中。用W3清洗蛋白，然后15 000g 4℃离心10min，弃上清，反复清洗、离心3 次。将样品放入真空干燥器中抽干，称蛋白的重量，然后将样品－20℃保存待用。用Bradford法对标本蛋白含量进行定量［8］，蛋白浓度按每管2mg分装，－80℃冰箱保存待用。

1.3 样品水化

将样品用10ml Lysis缓冲液（Lysis buffer：7M 尿素Urea，2M 硫脲thiourea，4%CHAPS，先加3 ml ddH2O 溶 解，溶解之后再加2%Ampholine（pH3.5～10）0.2 ml，定容至10ml）溶解，样品和Lysis的比例为1∶50，即1mg样品加50μl Lysis。样品放入振荡器充分溶解，大约40min以上。20 000g 4℃ 离心20 min。取出胶条在室温中缓冲10 min。将样品加入水化盘中，揭开胶条的保护膜后，将胶条盖在样品上，每根胶条盖上3ml矿物油，水化12h以上。

1.4 双向电泳操作程序

等电聚焦电泳程序步骤：300 V1h，600 V2h，1 000 V 1h，8 000V1h（梯度），8 000V，4h，500V，20h，累计51 900Vh。SDS－PAGE 步骤：等电聚焦结束前1h，封板制胶平衡，SDS－PAGE组程组序组设置：U＝800V，I＝25／根，P＝200W，T＝4∶00。看溴酚蓝指示剂的位置，停止电泳，固定40min考马斯亮蓝染色50min，脱色1.5h。

1.5 图像分析

运用D3000扫描仪扫描凝胶，Imagemaster 2D 蛋白分析软件对，对每张电泳图谱上寻找6 个标定点作为匹配点，根据匹配点的位置对其他蛋白质进行匹配，寻找差异点。蛋白质分子的等电点和分子质量根据IPG 胶条pH 标识、Marker范围和标准蛋白质用软件进行计算。对照组骨骼肌的蛋白质2－DE 代表图谱作为参考胶进行软件分析。

1.6 质谱鉴定及特异蛋白质分类

蛋白质鉴定采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI－TOF MS）技术分析进行，特异蛋白信息经NCBI Protein数据库中进行查新，质谱指纹数据通过Mas－cot搜索引擎进行查询。根据物种来源、蛋白质匹配率、肽段相对分子量等参数进行蛋白质鉴定。检索后，按照蛋白质在损伤修复中可能作用将蛋白质分为4 类，I代表线粒体酶系统及能量代谢相关蛋白，II代表参与细胞损伤修复蛋白，III代表骨骼肌组成的结构蛋白，IV 代表其他功能蛋白。

2 研究结果

2.1 一次大强度离心运动和一周后重复运动即刻组蛋白质组差异状况

经2－DE分离A0组和B0组蛋白质后，对比发现A0和B0之间共有62个蛋白质发生了变化，其中40 个蛋白质在B0组表达量出现了下调，22 个蛋白质在B0组表达量出现了上调。其中下调蛋白的表观等电点主要集中在pH4～6，表观分子量主要集中20～40 Ku 和50～60 Ku之间；表达量上调的蛋白质的表观等电点主要集中在pH5.5～6.5组之间，表观分组子组量组主组要组集组中组在30～50Ku之间。

图1 一次性大强度运动和一周重复运动后的即刻组大鼠股四头肌双向凝胶电泳图谱Figure 1.Two－dimensional Gel Electrophoresis Image of One and Repeated Eccentric Exercise Group in Quadriceps Femoris immediately after Exercise

表1 A0－B0组质谱鉴定的特异蛋白质信息一览表Tabel 1 Differente Expression Proteins in Quadriceps Femoris immediately after One and Repeated Eccentric Exercise

对表达量变化明显的19个特异蛋白质进行质谱鉴定发现，其中I类蛋白8个，只有异柠檬酸脱氢酶（三羧酸循环的限速酶）表达量上调，其余磷酸葡萄糖变位酶（糖酵解主要酶）、ATP 合成酶、丙糖磷酸异构酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶、血色素结合蛋白等表达量均下调；II类蛋白8个，表达量下调的蛋白质为血色素结合蛋白、胞内氯离子通道蛋白、蛋白磷酸酶、结合珠蛋白前体泛素羧基末端水解酶等；III类蛋白3个，分别为胎球蛋白A、三重基序蛋白72、结构域蛋白等；IV 类蛋白5个。

2.2 一次大强度离心运动和一周后重复运动后24h组蛋白质组差异状况

A24组和B24组蛋白质表达谱分析，发现共有47 个蛋白质发生了变化，其中8 个蛋白质在B0组表达量出现了下调，39个蛋白质在B0组表达量出现了上调，其中下调蛋白的表观等电点主要集中在pH5.1～6.3，表观分子量主要集中20～70Ku之间；表达量上调的蛋白质的表观等电点主要集中在pH4.2～7.0 之间，表观分子量主要集中在25～106Ku之间。

图2 一次性大强度运动和一周重复运动后的24h组大鼠股四头肌双向凝胶电泳图谱Figure 2.Two－dimensional Gel Electrophoresis Image of One and Repeated Eccentric Exercise Group in Quadriceps Femoris at 24hafter Exercise

表2 A24－B24组质谱鉴定的特异蛋白质信息一览表Table 2 Differente Expression Proteins in Quadriceps Femoris at 24hafter One and Repeated Eccentric Exercise

对表达量变化明显的21个特异蛋白质进行质谱鉴定发现，其中I类蛋白3个，并且相对表达量均出现上调，其中磷酸葡萄糖变位酶表达量上调5.1 倍，丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶表达量上调2倍，谷胱苷肽过氧化物酶表达量上调2.9倍；II类蛋白10 个，表达量上调的蛋白质有8 个，分别是α－辅肌动蛋白－3、蛋白磷酸酶1调节亚基7、慢骨骼肌肌钙蛋白、肌球蛋白轻链3、谷胱苷肽过氧化物酶、双功能过氧化物酶等，表达量下调的2个蛋白质为ATM 蛋白、胞内氯离子通道蛋白等；III类蛋白6 个，分别为线粒体内膜蛋白、肌球蛋白等；IV 类蛋白7个，表达量均出现上调。

2.3 一次大强度离心运动和一周后重复运动后48h组蛋白质组差异状况

图3 一次性大强度运动和1周重复运动后的48h组大鼠股四头肌双向凝胶电泳图谱Figure 3.Two－dimensional Gel Electrophoresis Image of One and Repeated Eccentric Exercise Group in Quadriceps Femoris at 48hafter Exercise

A48组和B48组蛋白质表达谱分析，发现共有49 个蛋白质表达量出现了变化，其中45 个蛋白质在B48组表达量出现了下调，4 个蛋白质在B48组表达量出现了上调。其中下调蛋白的表观等电点主要集中在pH5.0～6.5，表观分子量主要集中20～66Ku之间；表达量上调的蛋白质的表观等电点主要集中在pH5.9～6.6 之间，表观分子量主要集中在27～60Ku之间。

表3 A48－B48组质谱鉴定的特异蛋白质信息一览表Table 3 Differente Expression Proteins in Quadriceps Femoris at 48hafter One and Repeated Eccentric Exercise

对表达量变化明显的16个特异蛋白质进行质谱鉴定发现，其中I类蛋白8个，并且相对表达量上调的蛋白质1个，为β－E1丙酮酸脱氢酶，表达量下调的蛋白质7 个，分别为异柠檬酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、甘油－3 磷酸脱氢酶等；II类蛋白10 个，表达量均出现了显著性下调，分别是Ⅱ型细胞骨架1角蛋白、硫酸软骨素葡萄糖醛酸基转移酶、线粒体应急蛋白－HSP70、硫酸软骨素葡萄糖醛酸基转移酶、双功能过氧化物酶等；III类蛋白1 个，表达量下调，为Ⅱ型细胞骨架1角蛋白。

2.4 一次大强度离心运动和一周后重复运动后72h组蛋白质组差异状况

A72组和B72组蛋白质表达谱分析，发现共有46 个蛋白质表达量出现了变化，其中42 个蛋白质在B72组表达量出现了下调，4 个蛋白质在B72组表达量出现了上调，其中下调蛋白的表观等电点主要集中在pH4.8～7.0，表观分子量主要集中在20.1～97Ku之间；表达量上调的蛋白质的表观等电点主要集中在pH4.9～6.5之间，表观分子量主要集中在35～59Ku之间。

图4 一次性大强度运动和一周重复运动后的72h组大鼠股四头肌双向凝胶电泳图谱Figure 4 Two－dimensional Gel Electrophoresis Image of One and Repeated Eccentric Exercise Group in Quadriceps Femoris at 72hafter Exercise

表4 A72－B72组质谱鉴定的特异蛋白质信息一览表Table 4 Differente Expression Proteins in Quadriceps Femoris at 72hafter One and Repeated Eccentric Exercise

对表达量变化明显的23个特异蛋白质进行质谱鉴定发现，有22个蛋白表达量出现了显著下调，1 个蛋白表达量显著上调，1个蛋白质点消失；其中I类蛋白9 个，表达量均显著下调，其中丙酮酸脱氢酶E1 部分β亚基未检测到，其余M－型肌酸激酶、ADP 核糖基转化因子蛋白、6－磷酸葡萄糖酸内酯酶、糖原磷酸化酶、NADH 辅酶氧化还原酶、谷胱苷肽过氧化物酶1、磷酸酶2C 蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶等表达量均下降了2.0～5.2倍之间；II类蛋白8个，其中Ⅱ型细胞骨架1 角蛋白表达量上调2.4倍，其余蛋白质表达量均出现了显著性下调，分别是泛素羧基末端水解酶、免疫球蛋白λ链、谷胱苷肽过氧化物酶、慢骨骼肌肌钙蛋白、线粒体应急蛋白－70、前列腺素还原酶2、β－烯醇化酶等表达量下降1.8～5.5 倍之间；III类蛋白7个，分别为39S核糖体蛋白、内质网驻地蛋白29、慢骨骼肌肌钙蛋白、Ⅱ型细胞骨架1角蛋白、肌球蛋白1／3 轻链等；IV 类 蛋 白5个。

2.5 一次大强度离心运动和一周后重复运动后168h组蛋白质组差异状况

图5 一次性大强度运动和一周重复运动后的168h组大鼠股四头肌双向凝胶电泳图谱Figure 5.Two－dimensional Gel Electrophoresis Image of One and Repeated Eccentric Exercise Group in Quadriceps Femoris at 168hafter Exercise

表5 A168－B168组质谱鉴定的特异蛋白质信息一览表Table 3 Differente Expression Proteins in Quadriceps Femoris at 168hafter One and Repeated Eccentric Exercise

A168组和B168组蛋白质表达谱分析，发现共有26个蛋白质表达量出现了变化，其中4 个蛋白质在B168组表达量出现了下调，22个蛋白质在B168组表达量出现了上调，其中下调蛋白的表观等电点主要集中在pH6.1～7.0，表观分子量主要集中在41.3～62.0Ku之间；表达量上调的蛋白质的表观等电点主要集中在pH4.0～6.8 之间，表观分子量主要集中在20.1～60.8Ku之间。对表达量变化明显的12个特异蛋白质进行质谱鉴定发现，有3个蛋白表达量出现了显著下调，8 个蛋白表达量显著上调。I类蛋白5个，其中2个表达量均显著下调，其中NADH 脱氢酶、丙酮酸激酶同功酶表达量分别下降了2.3倍和1.9 倍；3 个蛋白质表达量显著上调，其中过氧化物酶－6、磷酸丙糖异构酶、血色素结合蛋白表达量分别上调了1.8倍、2.8组倍组和2.0组倍；II类组蛋组白2组个，其组中组表达量均出现了显著性上调，分别是NDRG2蛋白、蛋白酶体亚 基β－6，表达组量组分组别组上组调2.5组倍组和4.7组倍；III类组蛋组白3个，其中内质网驻地蛋白29未新检测到的蛋白，其余线粒体内膜蛋白表达量下降了1.7倍，血色素结合蛋白表达量上升了2.0倍等；IV 类蛋白2个。

2.6 一次大强度离心运动和1周后重复运动后特异蛋白质表达情况汇总

图6 一次大强度离心运动和1周后重复运动后特异蛋白质分类表达情况示意图Figure 6.The Kind of Different Expression Protein in Quadriceps Femoris after One and Repeated Eccentric Exercise

从图6可知，I类蛋白表达在重复运动组中主要表现为下调为主，特别是在运动后即刻至运动后72h 之间，A组中I类蛋白表达量上调的蛋白数目较B组有明显增加，而B组与A组比较，特异性蛋白主要以表达量下调的蛋白质为主。II类蛋白表达在0～72h之间与I类蛋白表达趋势类似，在B组中主要以下调为主。B组中III类蛋白表达在0～24h内上调和下调数目无显著差异，在72h时，下调数目明显多于上调蛋白数目。IV 类蛋白在B组中则表现为上调、下调交替出现。

通过对A组和B组特异蛋白质在0～168h内表达差异出现频次的比较，发现共有18 个蛋白质出现2 次以上表达量变化，其中角蛋白、血色素结合蛋白、磷酸丙糖异构酶等3个蛋白质表达量出现了3 次显著性变化，说明在一次大强度离心运动及重复运动后导致的微损伤修复过程中，上述蛋白属于表达相对活跃的蛋白质。在上述18 个特异性蛋白中，I类蛋白6个，II类蛋白12 个，III类蛋白7个。

3 讨论

下坡跑过程中，由于受试者本身需要抵抗身体的重量进行运动，从而使肌肉组织承受一定负荷而进行离心收缩，易发于骨骼肌离心运动时相造成骨骼肌微损伤，这也是比较典型的骨骼肌损伤病理模型［3，4］。一次离心运动后，骨骼肌损伤具有延迟现象，损伤在24h后出现明显结构变化，运动后7d后损伤骨骼肌超微结构基本恢复［12］。本研究组前期研究发现，重复运动较一次大强度离心运动促进肌纤维再生及骨骼肌重建，特别是48～168h内线粒体结构与数量恢复速度加快［1］，说明在一次大强度离心运动可能引起骨骼肌线粒体出现融合－分裂适应机制，在重复运动过程中线粒体的结构和数量较第一次运动后恢复速度明显加快，可能促进受损组织有氧代谢能力提高，从而有利于受损组织再生。前人通过对急性力竭运动后大鼠骨骼肌蛋白质组差异性表达发现，大鼠股四头肌蛋白质在大强度跑台运动后产生了明显的蛋白质新增和缺失（质）及表达量上调和下调（量）的变化，但是，该研究未对特异性蛋白进行鉴定。另外，短期连续的离心训练后，骨骼肌中Calpain 和Ubiquitin 的动态变化几乎与骨骼肌超微结构的动态变化相一致［2］。因此，损伤结构变化与蛋白质变化之间存在一定关联。本研究通过对一次大强度运动及一周后重复运动后骨骼肌微损伤恢复过程中骨骼肌蛋白质组变异，分析一次大强度运动及重复运动后损伤修复过程中起作用的特异蛋白质。

表6 特异性蛋白表达频次及表达时间对应一览表Table 6 The Expression Frequency and Time of Specific Protein

按照功能对特异蛋白质进行分类，发现损伤修复过程中能量代谢相关蛋白（I类）属于表达活跃的一组蛋白。其中参与有氧代谢的主要酶分别是异柠檬酸脱氢酶、磷酸葡萄糖变位酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶、血色素结合蛋白，参与糖酵解过程的有丙酮酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶。异柠檬酸脱氢酶主要参与三羧酸循环，是三羧酸循环的限速酶，负责催化异柠檬酸氧化脱羧成α－酮戊二酸，并将氧化型NAD 还原成NADH，决定着生物体有氧氧化功能的速率。磷酸葡萄糖变位酶催化葡萄糖－1－磷酸盐和葡萄糖－6－磷酸盐相互转化。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（NADH 脱氢酶）是线粒体电子传递链中第一个酶，也是电子传递链中含量最多且最复杂的一种酶。血色素结合蛋白存在于人血清中的高丰度β1 糖蛋白，对血红素有高亲和力，对于人体利用氧的能力起关键作用。丙酮酸脱氢酶是丙酮酸脱氢酶复合体中的主要组成成分，该复合体是生物体内催化丙酮酸转变成乙酰辅酶A 之反应的3种酶及5种辅酶的组合，所参与的反应名称是丙酮酸脱羧，是连结糖酵解（最终产物为丙酮酸）与柠檬酸循环（起始反应物为乙酰辅酶A）的一连串化学反应。磷酸丙糖异构酶能快速催化丙糖磷酸异构体在二羟丙酮磷酸和D－甘油醛－3－磷酸之间的可逆转化，在糖酵解的过程具有很重要的作用。同时，表6中显示I类蛋白主要出现在损伤修复后72h之内，与前期本研究组对损伤后超微结构变化情况规律基本一致，表明损伤后72h 内是损伤细胞能量供应逐渐恢复的阶段［9，14］。因此，在一次大强度运动及重复运动过程中，受损组织有氧代谢及糖酵解过程的一些关键酶类活性变化比较显著，表明微损伤修复过程中能量代谢恢复速率可能是影响骨骼肌损伤修复的重要因素。

II类蛋白主要参与细胞损伤修复。在运动后即刻，B组II类蛋白除肌球蛋白可能因A组运动后一周内尚未完全恢复至初始值导致重复运动后含量较高之外，其余以下调为主，反映了重复运动即刻诱导的损伤程度明显比第一次大强度运动轻。胎球蛋白A 在0h 表达量出现明显变化，可能是因为胎球蛋白具有调理素作用，可以促进精胺介导巨噬细胞失活，下调致炎因子的释放，减轻氧化应激损伤，同时胎球蛋白具有促进巨噬细胞对炎症细胞的胞吞作用［5］；至运动后24h，B组参与细胞损伤修复的蛋白质较A组表达上调数目增多，说明在重复运动后24h后是损伤细胞重要修复期；至运动后48h，B组II类蛋白表达以下调为主，而A组类蛋白表达以上调为主，表明一次大强度运动后受损细胞修复主要从48h 后开始，而重复运动后则修复期为24h～48h之间进行。在重复运动后受损细胞修复过程中，主要有以下蛋白表达活跃：泛素羧基末端水解酶属于泛素蛋白水解酶复合体中重要酶类，能催化水解泛素羧基末端多肽链连接，起到去泛素化对蛋白质降解进行反向调节，影响细胞的代谢、分化、增殖、凋亡调控蛋白等。一次大强度运动后，泛素化蛋白含量增加，泛素蛋白酶体途径活性增强，加速骨骼肌收缩蛋白降解［2－3］。重复运动后0h和72h检测到泛素羧基末端水解酶含量明显下降，表明重复运动造成的骨骼肌收缩蛋白水解程度下降［11］。谷胱苷肽过氧化物酶1、双功能过氧化物酶为自由基清除酶类，在重复运动后0h 表达量上升，并分别在48h和24h后表达量下降，说明重复运动后即刻骨骼肌自由基清除能力加强。

TRIM72在骨骼肌中特定地表达，在细胞膜的修复中有很重要的作用，修复机制是在受伤部位进行成核的组装，特异性结合磷脂酰丝氨酸，作为一个氧化传感器，在损伤的膜上，进入细胞外的氧化环境在损伤的部位引起二硫键生成和同源寡聚化。这寡聚化为损伤部位募集包含TRIM72的泡囊而作为一个成核位置，引起膜补丁的生成。肌球蛋白是肌原纤维粗丝的组成单位，在重复运动后即刻表达量上升2.4倍，可能是因为重复运动募集更多骨骼肌参与离心运动，从而使更多肌球蛋白得以释放［13，15］；至72h，肌球蛋白表达量低于A组2 倍，可能是随着B组肌纤维重建发生在24～48h间，至72h肌纤维重建较A组完整导致［1］。线粒体内膜蛋白表达在B组重复运动后24h和72h显著变化，并且其变化早于内质网驻地蛋白的变化，可能是因为线粒体是骨骼肌损伤修复阶段较早恢复的亚细胞器。

［1］董贵俊，吕晨曦，葛新发，等.一次和重复大强度离心运动前后大鼠骨骼肌超微结构变化［J］.中国运动医学杂志，2013，32（2）：167－173.

［2］金其贯，刘霞，李淑艳，等.反复离心运动对大鼠骨骼肌损伤和蛋白质降解机制的影响［J］.体育科学，2010，30（6）：76－80.

［3］金其贯，刘霞，李淑艳，等.反复离心运动致骨骼肌超微结构变化的实验研究［J］.西安体育学院学报，2010，27（4）：454－456.

［4］田野，马鹏鹏，郭时杰，等.连续运动后延迟性肌肉损伤的适应性研究［J］.中国运动医学杂志，2003，22（2）：138－142.

［5］吴泳贤，蒙勇燕.胎球蛋白A 与肾结石形成的关系［J］.国际泌尿系统杂志，2012，32（6）：819－823.

［6］张翔，张学林，许寿生.运动与骨骼肌超微结构变化［J］.中国运动医学杂志，2010，29（1）：109－113.

［7］朱荣，马延超，王瑞元.一次大强度运动对大鼠骨骼肌泛素蛋白酶体途径基因表达及蛋白质降解的影响［J］.中国运动医学杂志，2012，31（5）：414－419.

［8］BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72：248－254.

［9］BUTTERFIELD T A，HERZOG W.Magnitude of muscle straindoes not influence serial sarcomere number adaptations following eccentric exercise［J］.Pflugers Arch，2006，451（5）：688－700.

［10］CHEN T C.Variability in muscle damage after eccentric exercise and the repeated bout effect［J］.Res Q Exe Sport，2006，77（3）：362－371.

［11］MARGINSON V，ROWLANDS A V，GLEESON N P，etal.Comparison of the symptoms of exercise－induced muscle damage after an initial and repeated bout of plyometric exercise in men and boys［J］.J Appl Physiol，2005，99（3）：1174－1181.

［12］MATSUURA N，KAWAMATA S，OZAWA J，etal.Injury and repair of the soleus muscle after electrical stimulation of the sciatic nerve in the rat［J］.Arch Histol Cytol，2001，64（4）：393－400.

［13］MORGAN D L，PROSKE U.Popping sarcomere hypothesis explains stretch－induced muscle damage［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2004，31（8）：541－545.

［14］N M A VAN DEN BROEK，J CIAPAITE K NICOLAY，etal.comparison of in vivo postexercise phosphocreatine recovery and resting ATP synthesis flux for the assessment of skeletal muscle mitochondrial function［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2010，299：C1136－C1143.

［15］YU J G，CARLSSON L，THORNELL L E.Evidence for myofibril remodeling as opposed to myofibril damage in human muscles with DOMS：An ultrastructural and immunoelectron microscopic study［J］.Histochem Cell Biol，2004，121（3）：219－227.