红树植物内生真菌的分离鉴定及抗菌活性菌株的筛选＊

陈昭华，伍 菱，杨秋明，王骥妍，朱敏佳，杜希萍，2，3，4

(1.集美大学生物工程学院，福建 厦门 361021;2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门 361021;3.福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心，福建厦门 361021;4.厦门市食品与生物工程技术研究中心，福建厦门 361021)

内生真菌(endophyte)是指生活于健康植物组织内部、不引发植物产生明显病症的一类真菌。不但对促进宿主植物的生长发育，增强抗逆性起到重要作用，而且许多内生真菌能产生与宿主相同或相似的生物活性物质［1-2］。目前已从植物内生真菌中发现多种具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗菌、杀虫、免疫抑制、酶抑制剂或激活剂等活性代谢产物，在医药业、农业的生物防治方面都显示出重要的应用价值［3-6］。

红树植物(mangrove)是热带和亚热带潮间带木本植物群落，通常生长在港湾河口地区的淤泥滩涂上，是海滩上特有的森林类型和重要的生态系统。由于所处的高温、高盐、频繁潮汐、缺氧、强风、强紫外线的独特的生存环境，致使其内生真菌次级代谢产物结构类型丰富多样且具有不同的生物活性［7-8］，是许多具有各种活性的先导化合物的重要来源之一。

本文从福建省厦门市集美区红树植物无瓣海桑(Sonneratia apetala)，海 马 齿 (Sesuvium portulacastrum)和秋茄(Kandelia candel)的根、茎、叶中分离培养其内生真菌，并对其进行形态鉴定，了解红树植物内生真菌在不同植物和不同器官上的分布情况;同时针对多种指示菌进行抗菌活性测试，从中筛选出具有抗菌活性物质的产生菌，为药用微生物资源的研究、开发和利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 无瓣海桑(Sonneratia apetala)，海马齿(Sesuvium portulacastrum)和秋茄(Kandelia candel)3种红树植物的根、茎、叶采集自福建省厦门市集美红树林区。

1.1.2 培养基 (1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) 4%PDA培养粉，20%海水，2%琼脂，121℃灭菌20 min。(2)牛肉膏蛋白胨培养基 1%蛋白胨，0.5%牛肉膏，0.5%NaCl，2%琼脂，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 供试指示菌 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。

1.2 方法

1.2.1 红树内生真菌的分离与纯化 采用组织块法进行分离［9］。将采集的根、茎、叶在水中冲洗干净，沥干水分。将茎用无菌刀片去除外皮层和木质部，取内皮层及韧皮部;根去除外皮。用无菌刀片将上述样品切成5 mm×5 mm的小块，依次用75%乙醇溶液浸泡振荡30 s，2%次氯酸钠溶液浸泡振荡3 min进行表面消毒，无菌水冲洗3遍，无菌滤纸吸干表面无菌水。将表面消毒后的组织块置于含有终浓度为50 mg/L庆大霉素的PDA平板上，28℃倒置培养。待培养基出现菌落，挑取边缘菌丝接种于新的PDA培养基上，连续纯化几代，得到纯化菌株。

1.2.2 菌种鉴定 按照《真菌鉴定手册》的方法，将纯化菌株接种到PDA培养基，28℃培养，定期观察并记录菌落形状、大小、表面质地、生长速度、是否产色素等，同时挑取边缘菌丝于载玻片，在显微镜下观察其菌丝特征及分枝情况、孢子和产孢器结构［10］，并参考《中国真菌志》［11］进行菌株的分类鉴定。

1.2.3 抗菌活性测定 用菌饼法测定内生真菌的抗菌活性［12-13］。用直径0.6 cm的打孔器在28℃生长14 d(PDA培养基培养)的内生真菌菌落边缘制备菌饼，然后分别将菌饼置于含金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌的牛肉膏蛋白胨培养基平板(指示菌菌悬液的终浓度为105CFU/mL)上，每株内生真菌对3种指示菌分别作2次重复。制好后的培养皿于37℃恒温培养1 d后观察，测其抑菌圈的大小。

2 结果与分析

2.1 红树植物内生真菌的分离结果

从采集到的红树植物无瓣海桑、海马齿、秋茄中共分离得到25株内生真菌(表1)。从表1可以看出，从无瓣海桑中分离得到的3株菌株全部来自于叶片。海马齿中由叶分离出5株，占总菌株数的56%，比例最高;其次是由茎分离出3株，占总数的33%;由根分离出1株，占总数的11%。而秋茄中分离得到比例最高的部位是根，分离到6株，占总数的46.15%;其次为叶片，分离出5株菌株，占总数的38.46%;由茎部分离到2株，占总数的12.38%。由此可见，不同植物和不同部位上分离到的内生真菌菌株数量有较为明显的差别。

表1 红树植物内生真菌的分离结果Tab.1 The result of endophytic fungi from mangrove plants

2.2 红树植物内生真菌的种属分布

本次分离得到的25株内生真菌，根据形态观察及分类结果初步鉴定，其中链格孢属7株，曲霉属6株，根霉属3株，长蠕孢属2株，红曲霉属2株，枝顶孢霉属2株，镰孢属1株，待定2株，其具体的种属分布情况见表2。

从表中可以看出:红树植物内生真菌有一定的种属多样性，以链格孢属和曲霉属为主，分别占菌株总数的 28.0% 和 24.0% 。

表2 内生真菌的种属分布Tab.2 The groups of endophytic fungi

2.3 抗菌活性内生真菌的筛选

表3 内生真菌抗菌活性的筛选Tab.3 Screening of endophytic fungi with antibacterial activities

表4 内生真菌抗菌活性的筛选Tab.4 Screening of endophytic fungi with antibacterial activities

采用菌饼法对分离到的红树植物内生真菌进行抗菌活性测定，指示菌为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌，结果如表3和表4所示。在分离到的25株内生真菌中，有19株菌株对至少一种指示菌有抑制作用，占分离菌株总数的76.0%;其中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌有抑制作用的分别有11株、15株、14株，分别占分离菌株总数的 44.0%、60.0%、56.0%。有13株菌株可抑制两种或三种指示菌，占分离菌株总数的52.0%;其中菌株 BY1、BJ3、BJ1、WY3、QJ4、QG5、QY1和QY2对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏杆菌同时有抑制作用;QJ3对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌同时有抑制作用;BY、WY1、QE2和QJ1对枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏杆菌同时有抑制作用。菌株BY1、BY2、QY1和QY2对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强(20 mm﹤抑菌圈≦30 mm)，其抑菌圈分别为 22.5 mm、20.5 mm、24.5 mm 和24.5 mm;菌株 BY4、BJ3、BJ1、WY3、QJ3、QJ4 和 QG5对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱(10 mm﹤抑菌圈≦20 mm)。菌株 WY3、QE1、和 QJ4对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强(30 mm﹤抑菌圈≦40 mm)，其抑菌圈分别为 34.0 mm、33.0 mm 和 32.0 mm;菌株QY1对大肠埃希氏杆菌的抑制作用最强(30 mm﹤抑菌圈≦40 mm)，其抑菌圈为30.5 mm。由此可见，红树植物中存在着丰富的具有较强的抗菌活性和广谱的抗菌作用的内生真菌。

3 讨论

植物内生真菌的生境特殊性决定了其既有理论研究的广度和深度，又有多方面的应用潜力，是个潜力巨大、尚待开发的微生物新资源［14］。红树植物根、茎、叶中生长着丰富的内生真菌，本文共分离到25株菌，其中，从茎和叶中分离到的内生真菌数量较多，占总菌株数的72.0%。地上部分的含菌数高于地下部分，可能是由于植物在其根际会释放出某些化学物质，抑制了根际微生物生长的缘故，也可能是由于光合作用的产物较多的集中于叶以及茎中，未能良好的向根部传递。红树植物内生真菌的种属分布和抗菌活性筛选实验表明，红树植物内生真菌不仅种属分布广泛，而且具有良好的抗菌活性，是寻求抗菌药物的宝贵资源。HPLC分析也发现，这些具有抗菌活性内生真菌的次生代谢产物类型丰富，采用活性跟踪法对其抗菌活性化合物的分离纯化和结构鉴定正在进一步进行中。

［1］林燕青，洪伟.植物内生真菌研究及应用前景［J］.福建林业科技，2012，39(3):186-193.LIN Yanqing，HONG Wei.Research and future application of plant endophytic fungi［J］.Journal of Fujian Forestry Sci and Tech，2012，39(3):186-193.

［2］马养民，赵洁.植物内生真菌抗菌活性物质的研究进展［J］.有机化学，2010，30(2):220-232.MA Yangmin，ZHAO Jie.Progress in antimicrobial components from endophytic fungi［J］.Chinese Journal of Organic Chemistry，2010，30(2):220-232.

［3］HUANG H B，FENG X J，XIAO Z E，et al.Azaphilones and p-Terphenyls from the mangrove endophytic fungus Penicillium chermesinum(ZH4-E2)isolated from the south china sea［J］.The Journal of Nature Products，2011，74(5):997-1002.

［4］孙红.两株红树林内生真菌次生代谢产物研究［D］.中国科学院研究生院硕士学位论文，2012.SUN Hong.Investigation of two mangrove endophytic fungi for secondary metabolites［D］.Master Degree Thesis of Chinese A-cademy of Sciences Graduate School，2012.

［5］CHOKPAIBOON S，SOMMIT D，BUNYPAIBOONSRI T，et al.Antiangiogenic effect of chamigrane endoperoxides from a thai mangrove-derived fungus［J］.The Journal of Natural Products，2011，74(10):2290-2294.

［6］STROBEL G，DAISY B，CASTILLO U，et al.Natural products from endophytic microorganisms［J］.The Journal of Natural Products，2004，67(2):257-268.

［7］刘爱荣，吴晓鹏，徐同.红树林内生真菌研究进展［J］.应用生态学报，2007，18(4):912-918.LIU Airong，WU Xiaopeng，XU Tong.Research advances in endophytic fungi of mangrove［J］.Chinese Journal of Applied E-cology，2007，18(4):912-918.

［8］张亮，刘艳辉，李新兰，等.红树林内生真菌Penicillium sp.生物碱类次级代谢产物研究［J］.三峡大学学报(自然科学版)，2011，33(3):105-108.ZHANG Liang，LIU Yanhui，LI Xinlan，et al.Alkaloid metabolites and their antimicrobial activity from mangrove endophytic fungus Penicillium sp.［J］.Journal of China Three Gorges University(Natural Sciences)，2011，33(3):105-108.

［9］董玉洁，朴美子，王懋存，等.长岛海洋生物内生真菌的分离及其抗老年痴呆活性筛选［J］.中国食品学报，2012，12(4):43-47.DONG Yujie，PIAO Meizi，WANG Maocun，et al.Isolation of endophytic fungi from marine organisms of changdaand anti dementia activity screening［J］.Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2012，12(4):43-47.

［10］冯欣，张丽琳，孟庆恒.一株渤海丝状海洋真菌的形态学及18s rDNA-ITS鉴定［J］.信阳师范学院学报，2009，22(1):74-77.FENG Xin，ZHANG Lilin，MENG Qingheng.Morphological and molecular identification of marine filamentous fungi from bohai［J］.Journal of Xinyang Normal University，2009，22(1):74-77.

［11］齐祖同.中国真菌志［M］.北京:科学出版社，1997:4-173.QI Zutong.Flora Fungorum Sinicorum［M］.Beijing:Science Press，1997:4-173.

［12］孙奎，苏印泉.无花果内生真菌的抑菌活性筛选［J］.安徽农业科学，2010，38(23):12455-12459.SUN Kui，SU Yinquan.Screening of antibacterial activities of endophytic fungi isolated from Ficus carica［J］.Journal of Anhui Agri Sci，2010，38(23):12455-12459.

［13］陆晓东，王琦.骆驼蓬内生真菌抑菌活性的研究［J］.菌物研究，2010，8(2):103-104.LU Xiaodong，WANG Qi.Study on antibacterial activities of endophytic fungi from peganum harmala［J］.Journal of Fungal Research，2010，8(2):103-104.

［14］邹文欣，谭仁祥.植物内生菌研究新进展［J］.植物学报，2001，43(9):881-892.ZOU Wenxin，TAN Renxiang.Recent advances on endophyte research ［J］.Acta Botanica Sinica，2001，43(9):881-892.