柠檬酸亚锡二钠对双孢菇罐头的护色作用

张婷婷， 夏文水， 姜启兴， 许艳顺

（江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

双孢菇（Agaricus bisporus）属草腐菌，中低温性菇类，含有丰富的蛋白和多糖具一定的抗癌活性，有抑制肿瘤、降低血压作用。我国稻草、麦草丰富，气候适合双孢菇生长，总产占世界第二位，主要加工产品为罐头，是中国果蔬加工的主导和传统出口产品，在国际贸易量中占首位，但双孢菇在加工过程中易变色，双孢菇的褐变主要是酶促褐变，酚类物质如邻苯二酚在多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，简称PPO）作用下发生酶促褐变形成醌类化合物，醌自身呈浅褐色，但醌类物质通过非酶聚合反应成为较高相对分子质量的暗褐色化合物；另有非酶褐变如还原性物质与多糖发生美拉德反应等[1-3]。

国内外已有对抑制酶促褐变的相关研究，Nerya研究发现二苯基磷酸（DPP）能渗入细胞组织而抑制少量PPO活力防止鲜切蘑菇褐变，但护色效果不佳且DPP在蘑菇组织内不稳定，易代谢分解[4]；抗坏血酸及其衍生物能抑制鲜切哈密瓜PPO酶活，但其自身易氧化而引起色变[5-6]；半胱氨酸不能抑制PPO酶活，但能与苹果酶促反应产物-醌类物质结合成无色硫化物从而抑制褐变[7]；Yue-Xiu Si研究发现橙皮素可通过降低PPO疏水性而抑制其活性[8]；Yueming Jiang研究发现用谷胱甘肽和柠檬酸能抑制荔枝PPO活性[9]。中国双孢菇罐头生产中普遍采用焦亚硫酸钠护色，虽控制褐变效果显著，但由于SO2残留有害于人体健康，所以国外禁止用于罐头生产[10]。所以需要找到一种新型的双孢菇罐头安全高效护色剂应，抑制褐变反应发生。

柠檬酸亚锡二钠（Disodium Stannous Citrate，简称DSC），具强还原性，在罐中逐渐消耗残余氧气，阻断食品由于空气氧化作用而引起的氧化腐败，延缓食品的氧化所引起的不利变化从而起到抗氧护色作用，保持食品的色泽和风味。金椗梁等研究发现柠檬酸亚锡二钠对鲜切藕产品低温保藏期间的褐变和PPO活力有明显抑制作用，可作为亚硫酸盐的一种替代物应用于鲜切莲藕产品中[11]。

作者以柠檬酸亚锡二钠作为护色剂，研究DSC处理对双孢菇罐头产品褐变及PPO活性的影响，并与常用护色剂进行比较和复合优化，旨在探索新型的安全高效护色剂代替亚硫酸盐及类似产品的非硫护色方法。

1 材料与方法

1.1 原料与设备

新鲜双孢菇：购于无锡市雪浪农贸市场，菌柄完整，菌盖直径3～4 cm，成熟未开伞；

柠檬酸亚锡二钠：西陇化工厂股份有限公司产品；焦亚硫酸钠、柠檬酸、植酸、CaCl2、VC均为分析纯；数型恒温水浴锅：HH-2，国华电气有限公司产品；紫外分光光度计：UV2100，尤尼柯（上海）仪器有限公司产品；高速冷冻离心机：4K15，SIGMA公司产品；高速组织捣碎机：DS-1，上海标本模型制造厂产品；色差仪：Ultra Scan PRO，上海信联创体电子有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 双孢菇罐头工艺流程 参照Zhimin Li[13-14]等的试验方法并略有修改，工艺流程如下：

选样→修剪→称重→清洗→切片→护色处理→预煮→冷却→沥干→挑选修整→装罐加汤→杀菌冷却→室温贮藏

1.2.2 DSC与常用护色剂对双孢菇切片预处理护色效果比较 选取无腐烂变质的新鲜双孢菇，洗去泥土，去根，剔除损伤、褐变的双孢菇，切分为0.5 cm左右的薄片，分别置于如表1所示不同质量分数的DSC、焦亚硫酸钠、柠檬酸、植酸、VC及NaCl护色溶液中在常温条件下处理15 min，取出沥干，测定多酚氧化酶活力（PPO）和褐变度（BD）。

1.2.3 双孢菇切片预处理复合护色剂各组分最佳配比的确定 在满足 《食品添加剂使用卫生标准》（GB 2760-2011）用量规定的前提下，以防止双孢菇切片酶促褐变为目的，在1.2.1单因素试验的基础上，采用正交实验方法正交试验如表2所示。以DSC、柠檬酸、植酸和VC为因素配制成复合护色液进行如表2所示L9（34）表正交实验，确定复合护色剂中个护色剂用量。分别以去离子水为空白参照CK1，以0.02%NaHSO3的护色液为对照组 CK2。护色后测定双孢菇褐变度BD和PPO残余酶活。

表1 双孢菇切片预处理护色剂的种类及质量分数筛选表Table 1 Arrange test of single factor of anti-browning agents for fresh -cut Agaricus bisporus pretreatment%

表2 鲜切双孢菇护色液因素水平表Table 2 Orthogonal design of anti-browning agents for fresh-cut Agaricus bisporus pretreatment

1.2.4 DSC与常用护色剂对双孢菇罐头护色效果比较 经1.2.2实验结果得出的最佳正交复合护色剂预处理过的菇片再经质量分数0.2%柠檬酸溶液预煮9 min后冷却、装罐，按表3所示配制成护色液汤汁制成双孢菇罐头，以空白（去离子水）为对照组。新鲜双孢菇制成罐头样品贮藏于室温（25℃）和自然光照条件下6个月，每隔一个月测定多酚氧化酶活力（PPO）和褐变度（BD）。

表3 罐头护色剂的种类及质量分数筛选表Table 3 Arrange test of single factor of anti-browning agents for canned Agaricus bisporus%

1.2.5 双孢菇罐头的复合护色剂各组分最佳配比的确定 参照Zhimin Li[12]等的试验方法，在含有质量分数0.30% 柠檬酸的护色液中，以DSC、植酸和氯化钙为三因素配制成复合护色汤汁进行L9（34）表正交实验制备罐头，以质量分数0.30%柠檬酸的护色液所得样品为空白参照CK3，0.02%NaHSO3的护色液所得样品为空白参照CK4。新鲜双孢菇制成罐头样品贮藏于室温（25℃）和自然光照条件下6个月，每隔一个月测定多酚氧化酶活力（PPO）和褐变度（BD）。

表4 罐头护色剂的种类及质量分数筛选表Table 4 Orthogonal design of anti-browning agents for canned Agaricus bisporus

1.2.6 褐变度的测定 参照Mohapatra D，Gemma Oms-Oliu[13-14]的方法，将处理好的双孢菇切片表面的水分用纸巾吸干，直接用色差仪测定。L*（亮度），a*（红-绿）和b*（黄-蓝）参数值通过反射测量。每组样品至少进行6次重复测定，取ΔE*平均值为褐变度BD。

1.2.7 多酚氧化酶活力的测定 粗酶液的提取：参照Fatih Kalyoncu、潘永贵等[15-16]方法，称取20 g样品，与80 mL预先冷冻至-26℃的丙酮一起倒入组织捣碎机中匀浆（20 000 r/min，2 min），迅速抽滤，保留滤纸上的沉淀部分，将沉淀薄层中的残留的丙酮用冷风吹去，至沉淀无丙酮味，将所得丙酮粉转移至 40 mL 0.1 mol/L PBS（pH 6.5）中搅拌 30 min，离心（4 ℃，10 000 r/min，20 min）。 所得上清液即为PPO粗酶液。

测定方法：在410 nm下测定粗酶液的紫外吸收分光光度值A410nm，比色皿中加入0.1 mol/L PBS 1.5 mL，0.1 mol/L邻苯二酚 1 mL，PPO粗酶液 0.5 mL，混匀后立即用410 nm比色，粗酶液加入后开始计时，每10秒记录一次A值随时间变化而变大，以吸光值为纵坐标，反应时间为横坐标，作吸光值-时间曲线，从最初直线线段斜率（ΔA/Δt）计算多酚氧化酶的活力（参比以缓冲液代替酶液）。酶活定义为：在测定条件下，每min引起吸光度变化0.01所需酶量。每组实验进行3次重复测定，取3次平均值。

2 结果与讨论

2.1 DSC对鲜切双孢菇的护色效果研究

2.1.1 DSC与不同护色剂对双孢菇切片预处理护色效果的影响 DSC与常用护色剂的护色效果比较见图1，由此可知，DSC与常用护色剂均能起到良好的护色作用，而且随着护色剂质量分数增大，鲜切双孢菇的PPO活力和褐变度的抑制效果逐渐增强，但增长速率渐趋平缓；各抑制剂护色效果依次为：焦亚硫酸钠＞DSC＞植酸＞柠檬酸＞VC＞氯化钠＞空白，尽管焦亚硫酸钠、DSC和植酸的质量分数较低，但其抑制效果均优于较高质量分数的VC、柠檬酸及氯化钠，其中质量分数0.02%～0.03%DSC的护色效果可与焦亚硫酸钠媲美，但经后者处理过的双孢菇切片过于苍白，失去了原本的灰白色质感。金椗梁研究发现，在pH 3～6条件下用DSC浸泡处理后的鲜切藕产品可保持较低的褐变度和多酚氧化酶活力[11]；植酸不仅能降低溶液pH值，还可与多种多价金属络合，从而抑制多价金属对PPO酶促反应的催化作用，由此起到护色作用[17]，B Dave、Lixiang Liu等研究发现其在加拿大大豆、苦丁茶等果蔬制品中取得了较为理想的护色效果[18-19]。

图1 常温光照条件下不同质量分数护色剂对双孢菇切片的护色效果比较Fig.1 Comparison analysis of browning inhibition effect of DSC and other anti-browning agents on freshcut Agaricus bisporus at room temperature（25℃）in natural light condition

2.1.2 双孢菇切片预处理正交实验结果分析 从实验结果可以看出，与2.1.1结果相比较，正交组复合护色剂对PPO活性抑制及防褐变的效果明显优于单一护色剂溶液，表明不同护色剂之间有一定的协同作用。根据表5正交分析结果可以得出，各因素对褐变度BD和PPO残余酶活的影响程度均依次为：DSC＞柠檬酸＞植酸 ＞VC，这与单因素试验结果相同。复合护色剂的最优参数组合为 （质量分数）：柠檬酸 0.2%，DSC 0.03%，植酸 0.02%，VC 0.03%，在最优护色处理下，菇片色泽呈现双孢菇特有的灰白色，形态正常，护色液清澈透明。

表5 双孢菇褐变抑制正交实验L9（34）结果Table 5 Result of orthogonal design for fresh-cut Agaricus bisporus pretreatment

2.2 DSC对双孢菇罐头的护色效果研究

2.2.1 DSC与不同护色剂对双孢菇罐头护色效果的比较 罐头汤汁的正交复配设计方案及实验结果如表2所示。由于双孢菇罐头在开罐期间PPO活性抑制率均在99.97%以上，故后期以褐变度BD作为主要参考因素。

图2 常温光照条件下各种护色剂对双孢菇罐头的护色效果比较Fig.2 Comparison analysis of anti-browning agents on canned Agaricus bisporus at room temperature（25℃）in natural light condition

不同护色剂对双孢菇罐头护色效果的影响结果如图2所示，数据结果为各护色剂的最大浓度实验组产品褐变度平均值。由图可知，焦亚硫酸钠和DSC防褐变效果最好，其次是植酸、柠檬酸和氯化钙，VC效果最差，褐变度与空白对照组相近，该组产品汤汁暗黄，菇片也呈现较深的黄褐色，这可能是由于VC虽有一定还原性[20]，但因其本身在高温杀菌过程中受热见光易发生自身氧化而褐变，从而导致色泽的变化，这与O.Lamikanra等[5-6]的研究结果相似。氯化钙的护色作用是通过保持细胞膜结构的完整性和稳定性，阻止底物与酶PPO的接触，延缓褐变的发生，同时对果肉具有明显的护脆效果[19-21]。焦亚硫酸钠组的汤汁和菇片均显黄色，且有苍白的感觉，失去了蘑菇本身的色泽，缺少真实感。故以DSC效果最佳。

2.2.2 双孢菇罐头正交实验结果分析 从表6双孢菇罐头正交试验结果可以看出，各因素对褐变度BD的影响程度均依次为：DSC>植酸>氯化钙，其中DSC和植酸对双孢菇罐头防褐变效果均有显著性影响；罐头护色汤汁的复合护色剂的最优参数组合为：DSC 0.03%+植酸0.02%+氯化钙0.30%。金椗梁研究发现，柠檬酸亚锡二钠可能具有较强还原性，可通过消耗罐中残余的氧气将Sn2+氧化成Sn4+来达到抗氧化目的，而在罐头中，柠檬酸和植酸可能对其的抗氧化性有一定增效作用[11，22]。

表6 罐头汤汁L9（34）配方试验结果Table 6 Result of orthogonal design for canned Agaricus bisporus

图3表示了分别以复合护色剂、柠檬酸亚锡二钠、焦亚硫酸钠及去离子水空白为汤汁护色液对常温光照条件下6个月保存期内的双孢菇罐头的护色效果比较，数据结果为各实验组产品褐变度平均值。由图可知，与空白组相比较，经护色液处理过的产品的褐变程度均得到了有效抑制，在双孢菇罐头的6个月保藏期内，正交复合护色剂取得了最佳的护色效果，而柠檬酸亚锡二钠的褐变抑制效果与亚硫酸钠相当。

3 结语

图3 常温光照条件下复合护色剂与其他护色剂对双孢菇罐头的护色效果比较Fig.3 Comparison analysis of compound color fixative and otheranti-browningagentson canned Agaricus bisporus at room temperature（25℃）in natural light condition

1）与常用护色剂相比，DSC对双孢菇PPO活力和褐变度有明显的抑制作用，护色效果优于柠檬酸、植酸和氯化钙，而与焦亚硫酸钠效果相当；预煮前经质量分数 0.2%柠檬酸，0.03%DSC，0.02%植酸，0.03%VC复合护色剂浸泡处理15 min后的双孢菇可保持较低的褐变度和PPO活力，表明在预处理阶段，DSC对双孢菇切片酶促褐变的抑制作用是非常显著的；

2）DSC在双孢菇罐头中也有理想的褐变抑制效果，且DSC的复合护色剂汤汁质量分数0.03%DSC，0.02% 植酸，0.30% 氯化钙对双孢菇罐头在室温自然光照保藏期间质量分数均有非常显著的护色效果，可与0.02%焦亚硫酸钠媲美，各因素对其影响程度为：DSC>植酸>氯化钙。DSC可作为双孢菇罐头中替代焦亚硫酸钠的新型安全高效护色剂。

综上，双孢菇罐头的最佳工艺条件为：质量分数 0.2%柠檬酸，0.03%DSC，0.02%植酸，0.03%VC复合护色剂浸泡预处理15 min；再经0.2%柠檬酸溶液预煮9 min后冷却、装罐，按复合护色剂汤汁0.03%DSC，0.02%植酸，0.30%氯化钙制成双孢菇罐头，在室温（25℃）自然光照下保存，取得较好的褐变抑制效果。

迄今为止，国内外关于柠檬酸亚锡二钠对双孢菇的褐变抑制机理的研究较少，尚无明确清晰的原理分析，作者仅是应用DSC进行双孢菇罐头的初步试验，具体的作用机理还需进一步的研究。

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