林蛙皮胶原蛋白肽酶解工艺数学建模及抗氧化作用的研究

邱芳萍， 王长周， 季晓枫

（长春工业大学 化学与生命科学学院，吉林 长春 130012）

林蛙是我国东北地区集药、食于一体的珍贵蛙种，养殖量和商品量逐年增加，据不完全统计，全省年产蛙量在十亿余只，蛙油产量200 t左右，蛙油年产值10亿元左右，而蛙油仅占整蛙的15%，其它部位（脑、皮、肉和骨）作为废弃物或饲料，资源浪费，污染严重而林蛙皮中含有丰富的蛋白质、氨基酸、胶原蛋白、抗菌肽和透明质酸等生物活性物质，具有重要的应用价值及较大的开发利用潜力。

作者以长白山林蛙皮为原料，经酶解和膜分离手段等一系列工艺过程，建立了酶解最佳工艺的数学模型，制备出具有特殊分子结构、功能复杂多样的生物活性物质，对其溴代苯小鼠肝损伤及SOD、GSH-Px活力的影响进行了研究，以此证明：LWT可以作为新型的化妆品及保健品的原料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

昆明小鼠：雌性，体重25～30 g，吉林大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK-（吉）2008-0005；LWT：长春工业大学功能食品与生物技术研究所制备，批号：20101210；血红蛋白，SOD，MDA，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒：南京建成生物技术公司产品；丙烯酰胺，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

日普利RPL-D2000 COLUMN HBATER高效液相色谱：山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司产品；DYY-8C型电泳仪：北京市六一仪器厂产品。

1.3 方法

1.3.1 酶解工艺 蛙皮→溶胀→酶解→过滤→脱腥→活性炭脱色→膜分离纯化→浓缩→冷冻干燥→微黄色粉末状LWT

1.3.2 水解度的测定 采用游离氨基氮甲醛快速滴定法[2]测定林蛙皮的水解度。

1.3.3 酶解工艺的优化 采用数理统计和数据拟合分析方法对LWT酶解过程中的加酶量、酶解温度、酶解时间、pH、料液质量体积比5因素进行优化，建立LWT酶解过程中影响因素与水解度关系的数学模型。

1.3.4 相对分子质量测定 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳[3]的方法测定LWT的相对分子质量。

1.3.5 纯度检测 高效液相色谱分析条件[4]：紫外-可见光检测器；色谱柱：C18，250 mm×4.6 mm；流动相：v（乙腈）∶v（水）∶v（三氟乙酸）=20∶80∶0.1；波长：220 nm；流量：1 mL/min；柱温：30 ℃；质量浓度：1 mg/mL；进样量：15～30 μL。

1.4 抗氧化活性实验

取健康雌性昆明小鼠，随机分为对照组、模型组及LWT低剂量组 （200 mg/kg）、中剂量组（600 mg/kg）、高剂量组（1 800 mg/kg），每组各 15 只。3 个LWT组给予不同剂量连续等体积灌胃，对照组和模型组动物灌胃给予同等容量的生理盐水。

末次给药后，摘眼取血，分别SOD活力和GSH-Px活力[5]，除对照组，其余各组灌胃给0.47 mg/kg溴代苯油，对照组给予色拉油，灌胃量为0.2 mL/20 g。经一系列处理后，测定丙二醛质量分数和SOD活力和GSH-Px活力及匀浆液蛋白质质量分数。溶血液和肝组织的MDA质量分数采用硫代巴比妥酸（TBA）比色分析法[6]测定，血红蛋白、蛋白质质量分数、SOD、GSH-Px活力的测定参照试剂盒说明书进行。

2 结果与分析

2.1 最佳酶解条件的确定

采用数理统计和数据拟合分析方法建立酶解工艺优化条件的数学模型，把加酶量作为水解度的重要影响因子，其他酶解条件可以作为次要影响因子。由一元插值可确定pH、酶解温度、酶解时间3个变量与加酶量均有线性关系，可做如下假设：x为林蛙皮在酶解反应中加酶量的大小，且为水解度的第一影响因子；xi（i=1，2，3）为 x 的影响因子（其中，x1为酶的 pH，x2为酶解温度，x3为酶解时间）；y 为林蛙皮酶解反应后的水解度，这里其为目标函数；由实验数据得到如下关系曲线，见图1～3。

图1 酶解温度与加酶量的关系Fig.1 Relations between add enzymequantityand enzymatic hydrolysis temperature

图2 加酶量与pH的关系Fig.2 Relations between add enzyme quantity and pH

图3 酶解时间与加酶量的关系Fig.3 Relations between addenzymequantityand enzymatic hydrolysis time

根 据 上 面 数 据 可 知 ：x1=k1x+b1；x2=k2x+b2；x3=k3x+b3；其中 ki=1，2，3，b=1，2，3 为常数。

由上面的数据可确定如下：k1=5，b1=5.5，k2=25，b2=32.5，k3=2.5，b3=1.25。

从上面可得到x1与x之间的关系。

水解度是这里最为重要的指标，y=f（x）是目标函数。

y受两个因素的影响，一是加酶量的多少x（它与 xi，i=1，2，3 之间的关系已经讨论过），二是料液质量体积比。结果见图4，图5。

图4 料液质量体积比与水解度之间的关系Fig.4 Relations between hydrolyzing degree and ratio of solid to liquid

图5 加酶量与水解度之间的关系Fig.5 Relations between add enzymequantityand hydrolyzing degree

根据图4，曲线可由代数方程表示：令y=axk+b

水解度与酶解温度、酶解时间、pH值、酶量的大小均有直接的关系，通过实验给出的数据分析，当温度在50°、酶解时间约3.0、pH值时：

设水解度为 y（%），加酶量为 x（%），利用最小二乘法可得酶量与水解度之间的模型为：

如图 6（a），（b）所示：

图6 加酶量与水解度之间的关系模型Fig.6 Relational model between enzyme quantity and hydrolyzing degree

图6（a）是在加酶量1.5%范围内的局部情况，图6（b）较图6（a）的范围扩大了到了加酶量为10%的情况，分析上述结果，当加酶量在0.5%时，水解度可达到6.02%，当酶量在0.58%时，水解度可达到6.038%，当加酶量在0.6%时，水解度可达到6.04%，当酶量在1.2%时，水解度可达到6.10%，当酶量在8%时，水解度可达到6.247%。显然，当酶量x＞0.58时，水解度增加趋于平缓。

综上分析，确定最佳酶解条件为：加酶量0.55%～0.58%，酶解时间 3.0 h，酶解温度 50℃，pH 9.0，料液比1 g∶3 mL，经试验验证，酶解工艺条件与模型条件吻合。

2.2 相对分子质量分布

聚丙烯酰胺凝胶电泳结果见图7。

图7 聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig.7 Polyacrylamide gel electrophoresis figure

电泳结果显示，该LWT的相对分子质量在3 500以下，两个不同质量浓度的加样量基本上在同一相对分子质量水平上。

2.3HPLC图谱

高效液相色谱图表明LWT纯度较高，结果见图8。

图8 LWT高效液相色谱图Fig.8 HPLC figure of LWT

2.4LWT对小鼠血液中SOD、GSH-Px活力的影响

LWT低、中、高剂量组小鼠血液中SOD与GSH-Px活力与对照组相比较有所提高，但无统计学意义（P＞0.05），实验结果见表 1。

表1 LWT对小鼠血液中SOD、GSH-Px活力的影响Table 1 Influence of LWT on the SOD and GSH-Px vitality in mice blood

2.5 LWT对小鼠肝脏组织中MDA质量分数及SOD、GSH-Px活力的影响

模型组与对照组比较肝脏组织中MDA质量分数明显升高（P＜0.05）。LWT高剂量组小鼠肝组织中MDA质量分数与模型组相比显著降低，具有统计学意义（P＜0.05）；LWT高剂量组小鼠肝组织中SOD活力与模型组相比较显著升高，具有统计学意义（P＜0.05）；GSH-Px活力各组之间无显著性差异 （P＞0.05），实验结果见表 2。

表2 LWT对小鼠肝脏组织中MDA质量分数及SOD、GSH-Px活力的影响Table 2 Influence of LWT on the MDA content and the SOD and GSH-Px vitality in liver tissue

3 结语

对长白山林蛙进行了综合利用研究，运用数学建模优化酶解工艺条件，得到最佳酶解条件为：加酶量0.55%～0.58%，酶解时间3.0 h，酶解温度50℃，pH 9.0，料液质量体积比 1 g∶3 mL，在此条件下制备出LWT。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分析方法，证明了该LWT的相对分子质量均在3 500以下，且纯度较高。

通过小鼠实验，对所得数据进行统计学分析，最后得出结论：LWT具有显著降低小鼠肝组织中MDA含量和显著升高小鼠肝组织中SOD活力的作用，LWT的抗氧化动物实验结果为阳性，具有抗氧化作用。

林蛙由于生长环境和习性，其安全性、保湿性、抑菌抗菌性，抗氧化、抗衰老等方面都有独特的天然优势，是适用于新型化妆品基料的绿色材料。该LWT可以作为新型化妆品和保健品的原料，具有较大的开发潜力和较高的应用价值。

[1]何照范，张迪清.保健食品化学及其检测技术[M].北京：中国轻工业出版社，1997.

[2]夏其昌，张祥民，周仲驹，等.蛋白质电泳技术指南[M].北京：化学工业出版社，2007.

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