NEL样1型基因联合唑来膦酸预防股骨头坏死塌陷作用的初步观察

范 猛，姜文学，汪爱媛，彭 江，张 莉，许文静，卢世璧

1天津市第一中心医院骨科，天津300192

2中国人民解放军总医院骨科研究所，北京100853

股骨头缺血性坏死多见于30～40岁的青壮年，发病率逐年升高，其中多数患者都将进展为股骨头塌陷，需要进行人工关节置换手术［1］。人工关节置换手术早期疗效可靠，但远期仍有松动等情况，需要进行翻修手术［2］。目前有多种的保头治疗，包括:电磁刺激、近端旋转截骨、髓心减压和骨移植等，均有一定疗效，但多数患者的病情仍会进展至股骨头塌陷［3］。目前需要研究更有效的预防股骨头坏死塌陷的治疗方法。二磷酸盐具有抑制破骨细胞介导的骨破坏的作用，在多个基础及临床研究中都证实其具有抑制破骨细胞的骨吸收以及减少股骨头变形的作用。然而研究发现单独应用二磷酸盐治疗骨坏死，可以抑制骨流失而具有减少股骨头变形的作用，但是同时新骨形成却很少［4］，只是延缓了病情，最终仍会进展到塌陷［5］。Vandermeer等［5］提出，理想的骨坏死修复过程是在减少坏死骨吸收的同时，促进新骨的形成来提高骨量，保持股骨头的力学强度。本研究观察同时给予唑来膦酸和成骨因子NEL样1型基因 (NEL-like type 1 gene，NELL-1)的方式预防股骨头坏死塌陷的效果。

材料和方法

材料 雄性SD大鼠24只，体重 (392±24.2)g，由解放军总医院实验动物中心提供，按照SPF级别标准进行管理，自由饮食。NELL-1质粒为美国加利福尼亚大学洛杉矶分校Kang Ting教授惠赠，以腺病毒作为载体，构建NELL-1重组腺病毒载体，具体方法参考Xue等［6］报道方法。唑来膦酸由诺华药品公司(Norvartis Pharma AG)提供。使用仪器为美国GE eX-plore Locus小动物活体显微CT，最大分辨率27 μm，图像后处理软件为GE公司提供的GE Micro View。

动物模型的建立 将24只大鼠采用抽签法分为3组:假手术组、安慰剂组和NELL-1唑来膦酸联合治疗组，每组8只。安慰剂组和NELL-1唑来膦酸联合治疗组共16只参考Peled等［7］报道的方式建立模型:给予10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射进行麻醉，麻醉满意后术区脱毛，清洗备皮后碘伏消毒，铺无菌巾单，以大转子处为中心，取右髋部外侧切口，长约3 cm，分离皮下组织，钝性沿肌纤维方向分离臀大肌，牵开肌肉，切开髋关节囊显露股骨头，将髋关节脱位，切断圆韧带，钝性剥离股骨颈近端骨膜组织，将髋关节复位，保护坐骨神经并保持髋关节深层肌肉完整以避免术后髋关节脱位。生理盐水冲洗创面，分层关闭伤口。假手术组同另两组方法进行麻醉，在切开皮肤后钝性分离臀大肌后，生理盐水冲洗创面，分层关闭伤口。术后麻醉苏醒后均正常饮食及活动。

术后处理 术后1周，将唑来膦酸溶于生理盐水(1 mg溶于2 ml生理盐水)，按照0.2 ml/kg剂量即0.1 mg/kg给予NELL-1唑来膦酸联合治疗组单次皮下注射唑来膦酸生理盐水溶液，并给予0.2 ml含1×109噬斑形成单位的NELL-1重组腺病毒载体的生理盐水单次髋关节局部注射。安慰剂组及假手术组给予生理盐水0.4 ml/kg单次皮下注射。继续正常饮食及活动。术后5周，给予过量苯巴比妥钠肌肉注射处死。分别取出各组实验动物右侧股骨标本，给予4%多聚甲醛固定2周。

X光照相图像处理 行股骨标本前后位X光照相检查，曝光条件为32 kV，10 ms，放大比率×1。测量图像，分别测量股骨头的高度及宽度，并计算股骨头的高度及宽度的比值。

显微CT扫描 将股骨纵轴与显微CT检查床滑轨的移动轴平行近端进行显微CT扫描，扫描分辨率为27 μm，单次扫描时间86 min。对显微CT扫描的结果用标准体模校准后，手动选取股骨头区域建立三维兴趣区，兴趣区为完整股骨头区域。根据股骨头内骨质阈值分布选取1600 HU作为阈值进行计算，分别计算股骨头总体积、骨组织体积、骨体积分数 (骨组织体积/股骨头总体积)、骨矿密度、骨小梁厚度、骨小梁间隙宽度。

组织学检查 EDTA脱钙后股骨头冠状位切5 μm薄片，行组织学检查。分别行常规HE染色、抗酒石酸性磷酸酶 (tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色，骨桥蛋白 (osteopontin，OPN)、血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)免疫组织化学染色。

统计学处理 使用SPSS 17.0统计软件，所有数据以均数±标准差表示。组间数据比较采用单因素ANOVA分析 (One-way ANOVA test)，采用LSD检验进行各组的两两比较，采用卡方检验数据方差齐性。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

大体观察 各组动物在实验过程中均无死亡及伤口感染，患肢术后1周均可负重。处死取标本时各组股骨头均未见明显脱位，关节面未见明显骨性关节炎表现。NELL-1唑来膦酸联合治疗组见股骨头形态良好，安慰剂组可见股骨头轻度变扁。各组均未观察到异位成骨现象。安慰剂组股骨头冠状位切面存在明显骨吸收及股骨头形态改变，NELL-1唑来膦酸联合治疗组改变不明显 (图1)。

X光照相表现 安慰剂组股骨头明显变形，存在明显的骨吸收骨量减少。NELL-1唑来膦酸联合治疗组相对于假手术组仅存在轻度股骨头变形，股骨头整体形态保持良好 (图2)。治疗组股骨头高度与宽度比值明显高于安慰剂组 (P＜0.01)，而与假手术组比较差异无统计学意义 (P＞0.05)(图3)。

显微CT表现 显微CT图像可见安慰剂组股骨头变形明显，股骨头变小变扁;与假手术组相比，NELL-1唑来膦酸联合治疗组股骨头形态轻度变小，但远好于安慰剂组 (图4)。3组股骨头总体积、骨组织体积、股骨头骨矿盐含量NELL-1唑来膦酸联合治疗组和假手术组比较差异无统计学意义 (P＞0.05)，但均大于安慰剂组 (P＜0.01)。3组骨矿密度、骨小梁厚度和骨小梁间隙差异无统计学意义 (P＞0.05)(图5)。

组织学检查

HE染色:假手术组股骨头形态良好，骨小梁内骨陷窝均有骨细胞填充，NELL-1唑来膦酸联合治疗组股骨头形态良好，骨小梁排列整齐，股骨头内部分区域内骨陷窝内有骨细胞填充，部分区域内表现为空骨陷窝。安慰剂组股骨头高度变低，骨小梁较假手术组稀疏，且广泛存在以空骨陷窝为标志的坏死骨 (图6)。

图1 各组股骨头冠状剖面图Fig 1 Coronal images of femoral head in each group

图2 各组股骨标本X光照相前后位片Fig 2 Antero-posterior X-ray images of proximal femur

图3 股骨头高度与长度比值Fig 3 Comparison of the height and length ratio of femoral head among all groups

图4 各组标本的显微CT冠状位断层图像Fig 4 Coronal slice micro-CT images of proximal femur

TRAP染色:破骨细胞定义为TRAP染色阳性的靠近骨表面的有3个核以上的细胞。假手术组未发现股骨头内有明显的破骨细胞，股骨头内未发现死骨存在。安慰剂组股骨头内可见散在的破骨细胞。NELL-1唑来膦酸联合治疗组见股骨头内骨小梁较少量破骨细胞 (数量较安慰剂组少)(图7)。

OPN免疫组织化学染色:成骨细胞定义为OPN染色阳性，分布在骨边缘的方形的细胞。假手术组可见均为活骨，在软骨细胞与骨细胞交界区域，可见较多成骨细胞存在。安慰剂组可见死骨与活骨散在分布，在死骨与活骨交界区域，可见少量成骨细胞存在。NELL-1唑来膦酸治疗组活骨与死骨交替存在，在骨小梁边缘可见大量OPN染色阳性排列整齐的方形细胞 (图8)。

VEGF免疫组织化学染色:VEGF为血管内皮生长因子染色，显示血管新生情况。假手术组可见均为活骨，未见明显VEGF阳性表现。安慰剂组在死骨与活骨交替区域，即修复界面存在较多的VEGF阳性表现，显示存在较活跃的血管新生。NELL-1唑来膦酸联合治疗组显示以死骨活骨交替存在，以活骨为主，可见骨髓腔内较多的VEGF阳性表现 (图9)。

图5 各组股骨头总体积 (A)、股骨头内骨量 (B)、股骨头内骨量/股骨头总体积 (C)、股骨头骨矿盐含量 (D)比较Fig 5 Comparison of total volume(A)，bone volume(B)，bone volume/total volume(C)，and tissue mineralized content(D)among all groups

图6 股骨头HE染色结果Fig 6 HE staining of femoral head

图7 股骨头标本抗酒石酸性磷酸酶染色Fig 7 Tartrate-resistant acid phosphatase staining of femoral head

图8 股骨头标本骨桥蛋白免疫组织化学染色Fig 8 Immunohistochemical staining of osteopontin in femoral head

讨 论

在创伤性骨坏死的修复过程中，骨结构的破坏造成了关节功能的障碍。本研究观察到NELL-1联合唑来膦酸具有抑制破骨细胞活动并促进成骨细胞活动的作用，具有明显的减轻股骨头变形的作用。本研究将NELL-1用于骨坏死的保头治疗，并根据其作用机制和骨坏死病理过程联合唑来膦酸使用，在较好保持股骨头外形的情况下进行骨坏死的修复，预防了股骨头坏死的塌陷。比较3组间股骨头的体积、股骨头内骨量、股骨头骨矿盐含量，NELL-1和唑来膦酸联合治疗组与假手术组比较差异无统计学意义，明显大于安慰剂组。

本模型通过手术破坏股骨头及颈部的血运，成功建立了创伤性骨坏死动物模型，安慰剂组可见股骨头内广泛存在的空骨陷窝，且存在伴随的修复反应，存在死骨与活骨的修复界面，以及骨小梁结构的明显改变。通过显微CT检查发现股骨头形态变扁，股骨头体积减小，骨矿物量减小，存在明显的骨吸收现象。TRAP染色、OPN和VEGF免疫组织化学染色显示，存在破骨细胞活动、血管新生活跃以及成骨细胞活动，存在骨修复反应。所以本模型是成功的股骨头骨坏死创伤性动物模型。与假手术组比较，安慰剂组可见破骨细胞明显活跃，但成骨细胞活动无增加，从而造成了成骨活动落后于破骨活动，股骨头形态表现出明显的吸收表现。笔者认为这正是股骨头出现形态改变的原因。

与其他学者的报道［4，8-10］类似，本研究的前期研究中发现单独应用唑来膦酸治疗股骨头坏死，可以通过抑制破骨细胞的活动以及新生血管的形成而影响死骨的修复过程，但与安慰剂组股骨头内大量活骨存在相比，股骨头内仍以死骨表现为主，仅存在有限的修复反应，对于股骨头坏死后的成骨活动也有明显的抑制［11］。组织学检查显示，由于二磷酸盐对于修复反应的抑制造成其治疗后股骨头内死骨长期维持在无活力状态，虽然保存了股骨头的外形，但不是期望的恢复为具有良好排列和活力的健康状态，若要维持治疗效果必须进行长期用药。而且由于用药后表现为破骨细胞、成骨细胞和血管新生的全面抑制，所以其是降低了修复反应的强度，但并未纠正修复反应中成骨不足的失衡状态。使用二磷酸盐类进行股骨头坏死的治疗，只是延长了病程，拖延了出现股骨头塌陷的时间，并不会改变股骨头坏死的结局，经治疗后仍会出现股骨头的缓慢变形，甚至逐渐进展至塌陷［5］。

NELL-1是一种新近发现的具有特异性促进成骨细胞系分化的生长因子［12］。从分子机制上看，NELL-1直接受runt相关转化因子2(Runx2/Cbfa1)的调控。而Runx2/Cbfa1是控制成骨细胞生成及其功能的主要调控基因［13-14］。NELL-1作为一种细胞分泌因子并更专一的作用于进一步分化的成骨细胞系，因此NELL-1促进成骨的作用可能比骨形态形成蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)更专一［14-15］。NELL-1 可以通过膜内成骨和/或软骨成骨促进原位成骨。与BMP-2不同，NELL-1不会造成肌肉内的异位成骨，其作用机制为促进骨软骨前体细胞和骨髓基质干细胞的成骨分化，提高成骨细胞的OPN、骨钙素和BMP-7的表达，并促进骨矿化提高骨质量，相对于目前使用其他具有成骨活性因子的最大优势在于其特异性强，不会造成异位成骨［16］。NELL-1作用特异性在本研究中的优势表现明显，在 Vandermeer等［5］的研究中即便采用BMP-2股骨头内局部给药仍然发现存在异位骨化，而本研究则未发现异位成骨表现。

本研究在NELL-1联合唑来膦酸应用以后，体现为对破骨细胞的抑制和对成骨细胞的促进，对血管新生也具有一定程度的促进作用。NELL-1和唑来膦酸联合应用后通过抑制破骨细胞的活动以及促进成骨细胞的活动和新生血管的形成而影响了死骨的修复过程。股骨头内以活骨表现为主，存在明显的成骨细胞活动。X光照相测量股骨头高度宽度比及大体形态均显示其具有良好的预防股骨头塌陷的作用，显微CT显示股骨头形态较安慰剂组好，股骨头内无明显囊性变，骨量及骨形态都保持良好。组织学观察显示NELL-1和唑来膦酸联合应用具有在维持股骨头外形的情况下将股骨头内死骨置换为活骨的能力，从而有望实现骨坏死病程的逆转。同时因为其调控作用由两种因素协同完成，有望通过调整两种治疗因素的比例而实现对成骨/破骨的个体化调控，适应于不同个体的病理状态而实现个体化治疗。

本研究为探索性研究，仍存在着不足，如未充分观察NELL-1和唑来膦酸的作用周期、未观察NELL-1基因转染后成骨基因的改变、未观察用药对于全身其他部位/脏器可能存在的影响，同时因为本研究采用的动物模型为4足模型，髋关节负重较少，甚至在出现骨坏死之后可能基本不负重，且采用的为未成熟的动物模型，与成人机制不完全相同，所以本研究尚不能直接认为其对于人类的股骨头坏死治疗同样有效，仍需进一步的后续研究。

综上，笔者认为NELL-1和唑来膦酸联合应用于大鼠创伤性骨坏死动物模型可以促进成骨细胞活动，抑制破骨细胞活动，保存骨量和股骨头形态，具有良好的预防股骨头坏死塌陷的作用，有望实现骨坏死病程的逆转。

［1］Lavernia CJ，Sierra RJ，Griego FR.Osteonecrosis of the femoral head ［J］.J Am Acad Orthop Surg，1999，7(4):250-261.

［2］Mont MA，Rajadhyaksha AD，Hungerford DS.Outcomes of limited femoral resurfacing arthroplasty compared with total hip arthroplasty for osteonecrosis of the femoral head ［J］.J Arthroplasty，2001，16(8 Suppl 1):134-139.

［3］Reed KL，Brown TD，Conzemius MG.Focal cryogen insults for inducing segmental osteonecrosis:computational and experimental assessments of thermal fields ［J］.J Biomech，2003，36(9):1317-1326.

［4］Kim HK，Randall TS，Bian H，et al.Ibandronate for prevention of femoral head deformity after ischemic necrosis of the capital femoral epiphysis in immature pigs［J］.J Bone Joint Surg Am，2005，87(3):550-557.

［5］Vandermeer JS，Kamiya N，Aya-ay J，et al.Local administration of ibandronate and bone morphogenetic protein-2 after ischemic osteonecrosis of the immature femoral head ［J］.J Bone Joint Surg Am，2011，93(10):905-913.

［6］Xue J，Peng J，Yuan M，et al.NELL1 promotes high-quality bone regeneration in rat femoral distraction osteogenesis model［J］.Bone，2011，48(3):485-495.

［7］Peled E，Bejar J，Zinman C，et al.Prevention of distortion of vascular deprivation-induced osteonecrosis of the rat femoral head by treatment with alendronate ［J］.Arch Orthop Trauma Surg，2009，129(2):275-279.

［8］Bowers JR，Dailiana ZH，McCarthy EF，et al.Drug therapy increases bone density in osteonecrosis of the femoral head in canines［J］.J Surg Orthop Adv，2004，13(4):210-216.

［9］Little DG，McDonald M，Sharpe IT，et al.Zoledronic acid improves femoral head sphericity in a rat model of perthes disease ［J］.J Orthop Res，2005，23(4):862-868.

［10］Little DG，Peat RA，McEvoy A，et al.Zoledronic acid treatment results in retention of femoral head structure after traumatic osteonecrosis in young Wistar rats［J］.J Bone Miner Res，2003，18(11):2016-2022.

［11］范猛，姜文学，汪爱媛，等.唑来膦酸预防股骨头坏死塌陷的效果及机制 ［J］.中国医学科学院学报，2012，34(4):330-336.

［12］Zhang X，Kuroda S，Carpenter D，et al.Craniosynostosis in transgenic mice overexpressing NELL-1 ［J］.J Clin Invest，2002，110(6):861-870.

［13］Truong T，Zhang X，Pathmanathan D，et al.Craniosynostosisassociated gene NELL-1 is regulated by runx2 ［J］.J Bone Miner Res，2007，22(1):7-18.

［14］Yoshida CA，Furuichi T，Fujita T，et al.Core-binding factor beta interacts with Runx2 and is required for skeletal development［J］.Nat Genet，2002，32(4):633-638.

［15］Zhang X，Carpenter D，Bokui N，et al.Overexpression of NELL-1，a craniosynostosis-associated gene，induces apoptosis in osteoblasts during craniofacial development［J］.J Bone Miner Res，2003，18(12):2126-2134.

［16］Zhang X，Zara J，Siu RK，et al.The role of NELL-1，a growth factor associated with craniosynostosis，in promoting bone regeneration ［J］.J Dent Res，2010，89(9):865-878.